大鼠大隐静脉内皮细胞

方法简介  实验室分离的大鼠大隐静脉内皮细胞采用胰蛋白酶-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法、并通过内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠大隐静脉内皮细胞经CD31免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）或明胶（0.1%）

培养基： 大鼠大隐静脉内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠大隐静脉内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，每只可获得2-5x10^5个内皮细胞，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、兔抗细胞CD31抗体(用于流式分选)、ECM基质胶

分离纯化步骤

取实验动物目标血管/组织，用预冷PBS冲洗去除血液，仔细分离去除外膜和脂肪组织

将组织剪碎后加入0.25%胰蛋白酶，37度消化15-20分钟，收集消化液

再加入II型胶原酶，37度振荡消化45-60分钟，充分分散组织

消化液经70um和40um滤网依次过滤，300g离心10分钟收集细胞

用含CD31抗体的磁珠进行阳性/阴性分选，或采用差速贴壁法去除成纤维细胞，收集CD31+内皮细胞

原代培养要点

将纯化后的内皮细胞接种于明胶预包被的培养皿中，使用ECM基质胶包被可显著提高贴壁率

接种密度建议3x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养，内皮细胞通常24-72小时贴壁

使用内皮细胞专用培养基(含20%FBS、EGF 5ng/mL、FGF 2ng/mL、肝素10ug/mL)

每2-3天换液一次，细胞融合至80-90%时可用0.05%胰蛋白酶-EDTA传代

常见问题优化

内皮细胞被成纤维细胞污染：采用差速贴壁法2-3次，或CD31磁珠分选提高纯度

内皮细胞凋亡：培养基中添加ROCK抑制剂Y-27632(10uM)可显著提高存活率

表达内皮标志物下降：传代次数控制在3代以内，冻存早期细胞以备后续使用

一、实验前准备

1. 试剂：无菌肝素化 PBS、0.1%Ⅰ 型胶原酶、内皮细胞专用培养基、0.1% 明胶包被液。

2. 培养皿 / 培养瓶明胶包被过夜，次日 PBS 冲洗备用；解剖显微剪、镊子灭菌。

3. 水浴锅 37℃预热，超净台紫外灭菌。

二、取材与预处理

1. 大鼠麻醉固定，后肢腹股沟处剪开皮肤，分离并游离双侧大隐静脉，结扎两端血管。

2. 肝素 PBS 从血管一端缓慢灌注，冲净管腔内血液，剪下完整静脉血管段，置于冰 PBS 中。

3. 去除血管外侧脂肪与结缔组织，尽量保持血管管壁完整。

三、细胞分离与消化

1. 血管一端注入胶原酶消化液，夹闭两端，37℃水浴孵育 25~30min。

2. 剪开血管一端，吹打管腔内壁，洗脱内皮细胞，收集消化混合液。

3. 加入等量完全培养基终止消化，1000r/min 离心 6min。

四、纯化与接种培养

1. 弃上清，培养基重悬细胞沉淀，过 200 目筛除去组织碎屑。

2. 接种至明胶包被培养瓶，37℃培养，6h 后首次换液。

3. 利用差速贴壁纯化，去除平滑肌杂细胞，隔天换液，细胞融合后传代。