大鼠表皮角化细胞

方法简介  实验室分离的大鼠表皮角化细胞先中性蛋白酶消化、后胰蛋白酶-胶原酶混合消化法制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠表皮角化细胞经K1免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 大鼠表皮角化细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 上皮细胞样

传代比例： 不传代

传代特性： 不增殖；不传代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠表皮角化细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，组织取材量充足，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷无钙镁PBS反复冲洗去除血液和杂质，剪碎至1mm3大小

加入0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合消化液，37度消化30-40分钟，期间振荡2-3次

消化完成后加入含20%胎牛血清的完全培养基终止消化，用移液器反复吹打分散

依次过70um、40um细胞滤网过滤，300g离心8分钟收集细胞沉淀

用完全培养基重悬细胞，计数并检测活力，调整细胞密度后进行接种

原代培养要点

调整细胞密度至5x10^4-1x10^5 cells/cm2接种于胶原包被培养皿，37度、5% CO2培养

上皮细胞贴壁较慢，通常需24-48小时方可观察到贴壁细胞，建议48小时首次换液

培养基每2-3天更换一次，使用含10% FBS的DMEM/F12完全培养基

细胞融合达80-90%时可进行传代，建议采用温和的胰蛋白酶-EDTA(0.05%)消化传代

常见问题优化

细胞贴壁率低：使用多聚赖氨酸或胶原预包被培养皿表面，可显著提高贴壁效率

上皮细胞生长缓慢：培养基中添加0.1mM IBMX和5ug/mL胰岛素，可促进上皮细胞增殖

交叉污染：严格无菌操作，培养基中添加双抗(100U/mL青霉素+100ug/mL链霉素)

一、实验前准备

1. 试剂：Dispase II、0.25% 胰酶、KSFM 无血清角质细胞专用培养基、PBS、双抗。

2. 器械：无菌手术刀、镊子、6 孔板、离心管、细胞筛。

3. 新生大鼠皮肤组织，超净台常规灭菌，培养基 37℃预热。

二、取材与预处理

1. 乳鼠处死消毒，剪取背部无破损皮肤，PBS 充分漂洗。

2. 剔除皮下脂肪层，将皮肤浸入 Dispase II，4℃孵育 12~16h。

3. 钝性分离表皮层，真皮层丢弃，表皮用 PBS 清洗两遍。

三、细胞分离与消化

1. 表皮剪碎，加入胰酶 37℃消化 10~12min，间断吹打。

2. 加入等量 KSFM 培养基终止消化，吹打混匀。

3. 200 目筛网过滤，滤液离心 1000rpm 5min 弃上清。

四、纯化与接种培养

1. KSFM 无血清培养基重悬细胞沉淀，去除成纤维细胞污染。

2. 调整细胞密度接种培养瓶，37℃5% CO₂培养。

3. 每 2 天更换新鲜专用培养基，细胞汇合 70%~80% 时胰酶常规传代。