大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞

方法简介： 实验室分离的大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过

上皮细胞专用培养基培养筛选制备而来，细胞总量约为5×10? cells/瓶。

质量检测：实验室分离的大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞经SP-C免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、

HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm2）

培养基： 大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

生长特性： 贴壁

细胞形态： 上皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-2代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，

以此保证该细胞的最佳培养状态。

原代细胞功能最接近体内状态，但操作繁琐、表型维持时间短，适合短期高保真实验。

‌前置准备‌

实验动物：4-6周龄清洁级SD大鼠，每只可获得1.5-2.2×10⁶个细胞，活力>90%

试剂：0.25%胰蛋白酶、Ⅳ型胶原酶、DNase I、DMEM/F12完全培养基、大鼠IgG包被皿、Optiprep分离液

‌分离纯化步骤‌

大鼠麻醉后肝素抗凝，气管插管，经肺动脉用无钙镁PBS灌洗至肺完全苍白，完整取出心肺组织

经气管注入0.25%胰蛋白酶，37℃消化20分钟，剪碎肺组织后加DNase I，37℃振荡5分钟，胎牛血清终止消化

依次过120目、200目滤网，400g离心8分钟收集细胞沉淀

细胞悬液加入IgG包被培养皿，37℃孵育3小时去除巨噬细胞，收集上清后经Optiprep密度梯度离心，吸取中间层目标细胞，纯度可达90%以上

‌原代培养要点‌

调整细胞密度至1×10⁶ cells/mL接种，37℃、5% CO₂培养，24小时首次换液去除未贴壁细胞

‌36-72小时是实验黄金窗口期‌，此阶段SP-C表达量最高，96小时后细胞会逐渐向Ⅰ型细胞去分化，表型快速丧失

‌常见问题优化‌

细胞活力差：严格控制消化时间≤20分钟，除消化和培养步骤外全程冰上操作

纯度低：将IgG包被孵育时间延长至4小时，进一步去除巨噬细胞污染

表型快速丢失：培养基中添加10nM氢化可的松，可显著延缓细胞去分化进程

实验前置准备

‌实验动物‌：选用4-6周龄清洁级SD大鼠，提前12小时禁食，每只大鼠可获得1.5-2.2×10⁶个目标细胞，细胞活力>90% 。

‌试剂耗材‌：0.25%胰蛋白酶、Ⅳ型胶原酶、DNase I，DMEM/F12完全培养基（含10%FBS、2mM谷氨酰胺、双抗），大鼠IgG包被培养皿、Optiprep分离液，120目和200目细胞筛 。

取材与灌洗步骤

大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，肝素抗凝后固定于泡沫板，75%酒精消毒胸腹部。

打开胸腔，暴露气管和心肺，肺动脉插管，用预温无钙镁PBS灌洗至肺组织完全苍白，同时结扎右心耳放血。

完整取出心肺组织，去除气管、大血管和结缔组织，预冷PBS冲洗2-3次 。

组织消化步骤

经气管缓慢注入0.25%胰蛋白酶，使肺组织充分膨胀，37℃条件下消化‌20分钟‌。

将肺组织剪碎至1mm³左右，加入DNase I，37℃振荡5分钟，加入含10%FBS的培养基终止消化，避免细胞团聚 。

过滤与纯化步骤

细胞悬液依次过120目、200目细胞筛，去除未消化的组织碎片，400g离心8分钟，弃上清收集细胞沉淀。

细胞沉淀用完全培养基重悬，转移至大鼠IgG包被的培养皿，37℃孵育3小时，让巨噬细胞充分贴壁去除污染。

收集未贴壁的细胞上清，经Optiprep密度梯度离心，吸取中间层的目标细胞，此时细胞纯度可达90%以上 。

接种与培养步骤

调整细胞密度至‌1×10⁶ cells/mL‌，接种至提前用纤连蛋白包被的培养板/瓶。

放入37℃、5% CO₂培养箱培养，24小时后首次换液，去除未贴壁的死细胞和杂质。

36-72小时是实验黄金窗口期，此阶段SP-C特异性标志物表达量最高；96小时后细胞会逐渐向Ⅰ型肺泡上皮细胞去分化，表型完全丧失 。