绵羊传染性胸膜肺炎 (COPP)核酸检测试剂盒(荧光PCR 法)

【操作步骤】

1.试剂准备：（试剂准备区）

（1）从-20 ℃以下冰箱中取出试剂盒相应试剂，完全融化混匀后，快速离心数秒。

（2）按照20μL/管分装量将试剂分装至PCR反应管中。

（3）将PCR反应管转移至样本准备区。

2.核酸提取：（样本准备区）

病毒RNA的提取纯化，推荐使用本公司“病毒核酸DNA/RNA提取试剂盒（柱提法）”或者“核酸提取纯化试剂盒（适配机提）”。

阴性对照和阳性对照可以不经提取直接用于PCR扩增。

3.加样：（样本准备区）

每管加入样本模板5μL，阳性对照和阴性对照也各加5μL。先加阴性对照，再加样本，最后加阳性对照，加入后立即盖紧反应管，震荡混匀后快速离心数秒。

4. PCR扩增：（核酸扩增区）

（1）将PCR反应管放置在仪器样本槽相应位置，检测是否放置贴合，记录放置顺序。

（2）设置仪器运行参数，进行PCR扩增，反应体系设置为25 μL。

仪器运行参数

注：ABI系列荧光定量PCR仪不选ROX校正，淬灭基团选None。

【结果判定】

1.条件设定

综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考，阈值以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，不同仪器可根据仪器噪声情况进行调整。

2.对照标准

阳性对照：Ct值≤30并出现典型的S型扩增曲线，

阴性对照：无特异性扩增曲线或无Ct值；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

3.结果描述及判定

阳性：当被检样本出现特征性扩增曲线且Ct值≤35。

疑似样本，需要复测：样本检测结果38>Ct值>35，需要复测，若复测结果仍有Ct值，且扩增曲线呈现典型的S型扩增曲线，则判断为阳性，否则为阴性。

阴性：样品检测结果无Ct值或Ct值≥38，判为阴性。

对于某些未呈现特征性扩增曲线，但本底较高的样品，应判定为阴性。

【参考标准】

《核酸扩增检测用试剂（盒）（YY/T1182-2010）》

《基因检验实验室技术要求（SN/T1193-2003）》

【生产企业】  武汉光启生物科技有限公司

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