山羊传染性胸膜肺炎（CCPP）核酸检测试剂盒（荧光PCR法）

【产品名称】

通用名称：山羊传染性胸膜肺炎（CCPP）核酸检测试剂盒（荧光PCR法）

英文名称：Contagious caprine pleuropneumonia Detection Kit（Real-Time PCR Method）

【包装规格】50 T/盒

【产品用途】

本试剂盒适用于检测山羊的气管分泌物拭子、肺组织等样本中的传染性胸膜肺炎支原体，用于传染性胸膜肺炎支原体感染的辅助诊断。

【产品简介】

山羊传染性胸膜肺炎又称山羊支原体肺炎，是由多种支原体所引起的一种急性或慢性高度接触性传染病。引起山羊传染性胸膜肺炎的病原体为丝状支原体山羊亚种（Mycoplasma mycoides subsp capri,Mmc）、山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp）。传播途径：病羊是主要的传染源，其肺组织和胸腔渗出液中含有大量病原体，主要经呼吸道分泌物排出，通过空气-飞沫经呼吸道传染。发病后，在羊群中传播迅速，20天左右可波及全群。临床症状分为最急性型、急性型和慢性型。最急性型很快引起羊的死亡，并波及全群；慢性型可导致羊间歇性咳嗽、腹泻、流鼻涕，身体衰弱，皮毛粗乱无光，病程长的可持续数月，给羊养殖业造成巨大经济损失。荧光PCR检测技术因其简便、快捷、灵敏度高、特异性强，适用于的CCPP检测。

本试剂盒选取丝状支原体山羊亚种（Mycoplasma mycoides subsp capri,Mmc）、山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp）的16S rRNA基因的保守区，设计特异性引物探针，使用荧光定量PCR技术对传染性胸膜肺炎支原体的DNA进行体外扩增检测，用于临床上对疑似感染病料的病原学诊断。

【产品内容】

【贮存及有效期】

-20 ℃避光保存与运输，反复冻融次数不超过5次，有效期12个月。

【注意事项】

PCR检测方法具有极高的灵敏性，应用于临床检验必须采取严格的质控措施才能保证实验结果的准确性，在样本采集、核酸提取、扩增、产物分析、结果报告的整个流程都需严谨的质量控制。本项详细的列出了良好的动物疫病PCR检测实验室所应遵循的操作规范。

1. 病毒病料操作前必须做好个人防护，接触病料的物品应合理处置，以免污染实验室和环境。

2. 实验操作应分区域进行（试剂准备区、样本制备区、扩增区和产物分析区），每一区域都须有专用的仪器设备。各区域所用的仪器设备必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。

3. 样本进行处理时应在样本制备区指定的生物安全柜内进行，避免交叉污染。

4. 实验操作过程中，操作者必须戴手套，当怀疑手套有污染时就要更换手套。此外，操作中使用一次性帽子也是一个有效的防止污染的措施。

5. 用于扩增的试剂都应冰冻贮存。为避免因单次反应取液频繁地冻融，贮存试剂应分装冰冻贮存。分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来决定，试剂分装应在超净台中进行。

6. 在打开含有反应液或样本的离心管前，都要完全溶解后混匀，快速离心数秒。

7. 小心的打开或关闭各样本管，避免样本喷洒或喷溅出气溶胶，造成检测结果误差。

8. 使用带滤芯的一次性吸头操作，吸头不要暴露于空气中。

9. 根据所使用荧光定量PCR仪的要求选择合适的耗材，采用光学平盖的PCR管或八联管。

10. 勿将扩增产物带到反应配制区。

11. 用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器(含1%次氯酸钠溶液)内。含有PCR产物的任何废液必须收集到1 mol/L盐酸中，应到远离PCR实验室的地方弃掉。

12. 定期使用有效氯含量2 g/L的含次氯酸钠消毒剂清洁实验台，超净台及其他试验设备。

【样本采集】

病死或扑杀羊，无菌采集肺病变部位或病变/非病变部位交界处的样品；活羊灭菌棉拭子沾取气管分泌物，放入无菌试管中。

【样本前处理】

组织样品：取组织0.5g-1g剪碎，加入1mLPBS缓冲液，研磨成匀浆。将组织匀浆液100g离心5min，弃沉淀，取上清用于后续的核酸提取，如果上清液不足200μL，补充生理盐水至200μL。
    拭子样本：鼻拭子在1 mL PBS缓冲液中反复挤压，将挤下的液体100g离心5 min，弃沉淀，取上清用于后续的核酸提取，如果上清液不足200μL，补充生理盐水至200μL。

【操作步骤】

1.试剂准备：（试剂准备区）

（1）从-20 ℃以下冰箱中取出试剂盒相应试剂，完全融化混匀后，快速离心数秒。

（2）按照20μL/管分装量将试剂分装至PCR反应管中。

（3）将PCR反应管转移至样本准备区。

2.核酸提取：（样本准备区）

病毒RNA的提取纯化，推荐使用本公司“病毒核酸DNA/RNA提取试剂盒（柱提法）”或者“核酸提取纯化试剂盒（适配机提）”。

阴性对照和阳性对照可以不经提取直接用于PCR扩增。

3.加样：（样本准备区）

每管加入样本模板5μL，阳性对照和阴性对照也各加5μL。先加阴性对照，再加样本，最后加阳性对照，加入后立即盖紧反应管，震荡混匀后快速离心数秒。

4. PCR扩增：（核酸扩增区）

（1）将PCR反应管放置在仪器样本槽相应位置，检测是否放置贴合，记录放置顺序。

（2）设置仪器运行参数，进行PCR扩增，反应体系设置为25 μL。

仪器运行参数

注：ABI系列荧光定量PCR仪不选ROX校正，淬灭基团选None。

【结果判定】

1.条件设定

综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考，阈值以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，不同仪器可根据仪器噪声情况进行调整。

2.对照标准

阳性对照：Ct值≤30并出现典型的S型扩增曲线，

阴性对照：无特异性扩增曲线或无Ct值；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

3.结果描述及判定

阳性：当被检样本出现特征性扩增曲线且Ct值≤35。

疑似样本，需要复测：样本检测结果38>Ct值>35，需要复测，若复测结果仍有Ct值，且扩增曲线呈现典型的S型扩增曲线，则判断为阳性，否则为阴性。

阴性：样品检测结果无Ct值或Ct值≥38，判为阴性。

对于某些未呈现特征性扩增曲线，但本底较高的样品，应判定为阴性。

【参考标准】

《核酸扩增检测用试剂（盒）（YY/T1182-2010）》

《基因检验实验室技术要求（SN/T1193-2003）》

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