猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）核酸检测试剂盒 （荧光PCR法）

【产品名称】

通用名称：猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）核酸检测试剂盒

（荧光PCR法）

英文名称：Porcine deltacoronavirus Detection Kit (Real Time 

PCR Method)

【包装规格】50 T/盒

【产品用途】

本试剂盒适用于检测肠内容物和肠系膜淋巴结、排泄物等标本中的猪德尔塔冠状病毒，用于猪德尔塔冠状病毒感染的诊断。

【产品简介】

猪德尔塔冠状病毒（porcine delta coronavirus,PDCoV）是2012年中国香港首次发现的冠状病毒，主要引起猪的腹泻，各阶段猪均可感染发病，哺乳仔猪收到的危害最严重，易于其他猪病混感或继发多种疾病，致猪死亡率增加，给养猪业造成巨大经济损失。

本试剂盒对猪德尔塔冠状病毒基因组保守区设计特异性的引物和探针，用一步法荧光 RT-PCR技术对猪德尔塔冠状病毒RNA进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染病料的病原学诊断。

【产品内容】

【贮存及有效期】

-20 ℃避光保存与运输，反复冻融次数不超过5次，有效期12个月。

【注意事项】

PCR方法具有极高的灵敏度，应用于临床检验必须采取严格的质控措施才能保证实验结果的准确性，在样本采集、核酸提取、扩增、产物分析、结果报告的整个流程都要做好质量控制。本项详细的列出了良好的动物疫病PCR检测实验室所应遵循的操作规范。

1. 病毒病料操作前必须做好个人防护，接触病料的物品应合理处置，以免污染实验室和环境。

2. 实验操作应分区域进行（试剂准备区、样本制备区、扩增区和产物分析区），每一区域都须有专用的仪器设备。各区域所用的仪器设备必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。

3. 样本处理应在样本制备区指定的生物安全柜内进行。

4. RNA提取过程要注意防止RNA降解，尽量缩短操作时间，建议使用与科前公司提供的商品化核酸提取试剂盒配套使用。

5. 实验操作过程中，操作者必须戴手套，当怀疑手套有污染时就要更换手套。此外，操作中使用一次性帽子也是一个有效的防止污染的措施。

6. 用于扩增的试剂都应冰冻贮存。为避免因单次反应取液频繁地冻融，贮存试剂应分装冰冻贮存。分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来决定，试剂分装应在超净台中进行。

7. 在打开含有反应液或样本的离心管前，都要完全溶解后混匀，快速离心数秒。

8. 小心的打开或关闭各样本管，避免样本喷洒或喷溅出来。

9. 使用带滤芯的一次性吸头操作，吸头不要暴露于空气中。

10. 根据所使用荧光定量PCR仪的要求选择合适的耗材，采用光学平盖的PCR管或八联管。

11. 不要把扩增产物带到反应配制区。

12. 用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器（含1%次氯酸钠溶液）内。含有PCR产物的任何废液必须收集到1 mol/L盐酸中，应到远离PCR实验室的地方弃掉。

13. 经常使用有效氯含量2 g/L的次氯酸钠清洁实验台及设备。

【样本采集】

剖检猪取肠内容物和肠系膜淋巴结；待检活猪，取排泄物，于离心管中。

【样本前处理】

组织：分别从肠系膜淋巴结的3个不同位置取样，称取样品约1g，用手术剪剪碎混匀，再称取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液200μL于1.5ml灭菌离心管中；

排泄物：取0.5g于1.5ml灭菌离心管中，加入1mL生理盐水涡旋振荡，8000rpm离心2min，取上清液200μL于1.5mL灭菌离心管中。

【操作步骤】

1.试剂准备：（试剂准备区）

（1）从-20 ℃以下冰箱中取出试剂盒相应试剂，完全融化混匀后，快速离心数秒。

（2）在冰上准备主反应混合液，核算当次实验所需要的反应数（n），计算当次实验所需要的各种试剂量。考虑加样误差，可多配出5-10% 的量。

n =阴性对照数（1T）+阳性对照数（1T）+样本数+误差预留量

（3）按照20 μL/管分装量将试剂分装至PCR反应管中。

（4）将PCR反应管转移至样本准备区。

2.核酸提取：（样本准备区）

（1）病毒RNA的提取纯化，推荐使用本公司“病毒核酸DNA/RNA提取试剂盒（柱提法）或者“核酸提取纯化试剂盒（适配机提）”。

阴性对照和阳性对照可以不经提取直接用于PCR扩增。

3.加样：（样本准备区）

每管加入样本模板5 μL，阳性对照和阴性对照也各加5 μL。先加阴性对照，再加样本，最后加阳性对照，加入后立即盖紧反应管，震荡混匀后快速离心数秒。

4. PCR扩增：（核酸扩增区）

（1）将PCR反应管放置在仪器样本槽相应位置，记录放置顺序。

（2）设置仪器运行参数，进行PCR扩增，反应体系设置为25 μL。

注：ABI系列荧光定量PCR仪不选ROX校正，淬灭基团选None。

【结果判定】

1.条件设定

综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考，阈值以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，不同仪器可根据仪器噪声情况进行调整。

2.对照标准

阳性对照：Ct值≤32并出现特征性扩增曲线，

阴性对照：无特异性扩增曲线或无Ct值；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

3.结果描述及判定

阳性：当被检样本FAM通道Ct值≤35并出现特征性扩增曲线。

可疑：FAM通道35<Ct值≤38并出现特征性扩增曲线的样本，需重新取样提取RNA进行检测，若重新检测后仍35<Ct值≤38，且有特征性扩增曲线，可判定为阳性，否则判定为阴性；

阴性：被检样本FAM通道Ct值>38或无Ct值。

【参考标准】

《核酸扩增检测用试剂（盒）（YY/T1182-2010）》

《基因检验实验室技术要求（SN/T1193-2003）》

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