非洲猪瘟野毒和基因缺失毒鉴别诊断试剂盒（PCR-荧光法）

【产品名称】

通用名称：非洲猪瘟野毒和基因缺失毒鉴别诊断试剂盒（PCR-荧光法）

英文名称：A Triplex Real-Time PCR Assay Kit for Detection and Differentiation of Gene-Deleted and Wild-Type African Swine Fever Virus 【包装规格】50 T/盒

【产品用途】

适用于血清、血浆、全血、脾脏、淋巴结、扁桃体、口腔液、粪便、饲料、环境样品等样品中非洲猪瘟野毒、MGF360-505R 基因缺失毒和 CD2v基因缺失毒核酸的鉴别诊断。

【产品内容】

【贮存及有效期】

-20℃以下储存，有效期为 12 个月。

【注意事项】

1.   病毒病料操作前必须做好个人防护，接触病料的物品应合理处置，以免污染实验室和环境。

2.   实验操作应分区域进行（试剂准备区、样本制备区、扩增区），每一区域都须有专用的仪器设备。所有台面、地面可以使用 10%次氯酸钠清洁。

3.   本品使用保存过程应注意避光，尽量避免反复冻融。如每次使用量较少，推荐小份分装使用。

4.   各试剂组分在使用前均需充分融化，上下颠倒混匀，请勿涡旋以免产生过多气泡，轻微离心后再开盖使用。

5.   本品检测灵敏度极高，空气中微量的核酸气溶胶可以引起污染，推荐使用专用的移液器，使用带滤芯的一次性吸头。使用过的枪头应打到含 10%次氯酸钠的废物缸中，检测结束的 PCR 反应管严禁开盖。

【操作步骤】

1.  样品采集处理

猪场日常监测：可采集鼻、咽、肛三拭子或尾根血。

对可疑猪，按检出概率高低排序，依次采集深部咽拭子、淋巴结（微创采集）、前腔静脉抗凝血（EDTA）或尾根血、口鼻拭子；对分娩母猪，应采集脐带血、胎衣；对死胎和流产胎儿，应采集淋巴结、脾脏等组织样品；

对病死猪，优选采集部位为淋巴结、脾脏、骨髓和肺脏；

血清样本，按常规方法制备。

口鼻拭子：用尼龙拭子在口腔或鼻腔转动至少 3 圈，采集口腔、鼻腔的分泌物，对于疑似弱毒株的检测建议采集深部咽拭子。拭子浸入 1 ml 灭菌 PBS 中，剪去露出部分，充分振荡，2000～3000 rpm 离心 2 分钟，取上清液备用。

血液样品：使用真空采血管（含 EDTA 抗凝剂）采取全血 5 ml ，密封后冷藏或冷冻保存，对于日常监测可采取尾根血。

组织样品：取不少于 2.0 g 组织，研磨后用 5 倍体积灭菌 PBS 悬浮，4℃下以2000～3000 rpm  离心 10 分钟，取上清液进行核酸提取。

饲料、粪便：取 0.5~ 1 g 样品，加入 5 ml PBS ，充分振荡，取 1 ml 到 1.5 ml 离心管中，12000 rpm 离心 5 分钟，取上清液备用。

环境样本：使用脱脂棉或洁净纱布，用 PBS 或洁净水蘸湿，擦拭环境表面，将水挤到离心管中，2000～3000 rpm  离心 2 分钟，取上清液备用。组织样本要求新鲜，避免反复冻融，每份样品取样 50- 100 mg ，加 1 ml PBS 研磨匀浆后，2000 rpm 离心

10 分钟，取上清待用。

2.核酸提取

对样本进行处理，推荐使用本公司“病毒核酸 DNA/RNA 提取试剂盒（柱提法）”或者“核酸提取纯化试剂盒（适配机提）”提取得到的核酸取 5ul 作为 PCR 模板使用。

3.反应液配制

1）从-20℃以下冰箱中取出试剂盒相应试剂，完全融化混匀后，快速离心数秒。

2）准备主反应混合液，核算当次实验所需要的反应数（n），计算当次实验所需要的各种试剂量。考虑加样误差，可多配出 5- 10%的量。                     n =阴性对照数（1T）+ 阳性对照数（1T）+样本数+误差预留量

3）反应体系按每管 20 μl 分装，然后加入提取好的样品核酸 5 μl ，设阴、阳性对照。盖好管盖，震荡混匀后快速离心数秒。

4.PCR 扩增

按下表进行 PCR 仪程序设定：

【结果判定】

1.  质控标准

阳性对照三个通道 Ct  值≤35  并出现典型的 S  型扩增曲线，阴性对照无 Ct  值或无特征性扩增曲线时实验成立。

2.  结果描述及判定：调节三个通道阈值线使得阳性对照三个靶基因的 Ct  值相差 1   以内，然后分析扩增结果：

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