猪流行性腹泻病毒（PEDV）核酸检测试剂盒（荧光PCR法）

【产品名称】

通用名称：猪流行性腹泻病毒（PEDV）核酸检测试剂盒（荧光PCR法）

英文名称：Porcine Epidemic Diarrhea Virus Detection kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】50T/盒

【产品用途】

本试剂盒适用于检测猪的肠内容物和肠系膜淋巴结、排泄物等标本中猪流行性腹泻病毒RNA，适用于猪流行性腹泻病毒感染的辅助诊断。

【产品简介】

猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死亡率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病。本病一年四季均可发生，病猪和隐性感染猪是本病的主要传染源，病毒通过粪-口途径或感染母猪的乳汁进行传播。本病与具有类似临床症状的猪传染性胃肠炎难以区分，荧光PCR技术为这2种病原的鉴别带来便利。

本试剂盒用一对猪流行性腹泻病毒特异性引物，结合一条特异性荧光探针，用一步法荧光RT-PCR技术对猪流行性腹泻病毒RNA进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【产品内容】

【贮存及有效期】

-20 ℃避光保存与运输，反复冻融次数不超过5次，有效期12个月。

【样本采集】

剖检猪取肠内容物和肠系膜淋巴结；待检活猪，取排泄物，于离心管中。

【样本前处理】

每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1 g，手术剪剪碎混匀后取 0.5 g 于研磨器中研磨，加入 1.5 mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5 mL 灭菌离心管中，8000 rpm 离心 2 min，取上清液 200 μL 于 1.5 mL 灭菌离心管中；排泄物：取 0.5 g 于 1.5 mL 灭菌离心管中，加入 1 mL 生理盐水涡旋振荡，8000 rpm 离心 2 min，取上清液 200μL 于 1.5 mL 灭菌离心管中。

【操作步骤】

1.试剂准备：（试剂准备区）

（1）从-20 ℃以下冰箱中取出试剂盒相应试剂，完全融化混匀后，快速离心数秒。

（2）在冰上准备主反应混合液，核算当次实验所需要的反应数（n），计算当次实验所需要的各种试剂量。考虑加样误差，可多配出5-10% 的量。

n =阴性对照数（1T）+阳性对照数（1T）+样本数+误差预留量

（3）在适当容积的无核酸酶离心管中加入上述试剂，混匀后快速离心数秒。按照20μL/管分装量将试剂分装至PCR反应管中。

（4）将PCR反应管转移至样本准备区。

2.核酸提取：（样本准备区）

（1）病毒RNA的提取纯化，推荐使用本公司“病毒核酸DNA/RNA提取试剂盒（柱提法）”。

阴性对照和阳性对照可以不经提取直接用于PCR扩增。

3.加样：（样本准备区）

每管加入样本模板5 μL，阳性对照和阴性对照也各加5 μL。先加阴性对照，再加样本，最后加阳性对照，加入后立即盖紧反应管，震荡混匀后快速离心数秒。

4. PCR扩增：（核酸扩增区）

（1）将PCR反应管放置在仪器样本槽相应位置，记录放置顺序。

（2）设置仪器运行参数，进行PCR扩增，反应体系设置为25 μL。

注：ABI系列荧光定量PCR仪不选ROX校正，淬灭基团选None。

【结果判定】

1.条件设定

综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考，阈值以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，不同仪器可根据仪器噪声情况进行调整。

2.对照标准

阳性对照：FAM通道、HEX通道Ct值均≤32并出现特征性扩增曲线，

阴性对照：无特征性扩增曲线或无Ct值

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

3.结果描述及判定

阳性：当被检样本FAM通道和HEX均出现特征性扩增曲线且FAM通道Ct值≤35。

可疑：HEX通道出现特征性扩增曲线，FAM通道35<Ct值≤38并出现特征性扩增曲线的样本，需重新取样提取RNA进行检测，若重新检测后仍35<Ct值≤38，且有特征性扩增曲线，可判定为阳性，否则判定为阴性；

阴性：被检样本HEX通道出现特征性扩增曲线且FAM通道Ct值>38或无Ct值；