HTRF 人磷酸化 AKT1/2/3（Ser473）检测试剂盒-瑞孚迪

产品特点

工作原理：
磷酸化 AKT（Ser473）检测原理：
磷酸化 AKT（Ser473）检测用于测量在 Ser473 位点磷酸化的 AKT。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板，不需要凝胶、电泳或转膜。磷酸化 AKT（Ser473）检测使用两种标记抗体，一种带有供体荧光团，另一种带有受体。第一种抗体因其对蛋白质上磷酸化基序的特异性结合而被选择，第二种抗体因其能够识别不依赖于其磷酸化状态的蛋白质的能力而被选择。蛋白质磷酸化使得涉及两种标记抗体的免疫复合物形成，这使供体荧光团与受体紧密接近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。其强度与样品中存在的磷酸化蛋白的浓度直接成正比，并在无需洗涤的检测形式下提供了一种评估蛋白质磷酸化状态的方法。

磷酸化 AKT（Ser473）双板检测方案：
双板方案涉及在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，接着将裂解物转移到 384 孔低体积检测板中，之后加入磷酸化 AKT（Ser473）检测 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和融合度。

磷酸化 AKT（Ser473）单板检测方案：
使用 HTRF 试剂检测磷酸化 AKT（Ser473）可以在一个用于培养、刺激和裂解的单板上进行。无需洗涤步骤。这个为高通量筛选设计的方案能够实现微型化，同时保持强大的 HTRF 质量。

检测验证：
在 HEK 293 细胞上进行的磷酸化 AKT（Ser473）检测 IGF 剂量反应：
在使用三种细胞密度（每孔 12,500 - 25,000 - 50,000 个细胞）接种的 HEK 细胞上获得的结果。在饥饿 24 小时后，用各种浓度的 IGF 刺激细胞 10 分钟。使用双板检测方案在 3.5 小时后测量磷酸化 AKT。

用总 AKT 来控制 AKT（Ser473）的磷酸化状态。
使用磷酸化 AKT（Ser473）和总 AKT 检测的双板检测方案，用 IGF-1 激活 HEK293 细胞（每孔 100,000 个细胞）10 分钟。正如预期的那样，获得的结果显示在 IGF-1 刺激下 AKT 磷酸化呈剂量反应性增加，而 AKT 的表达水平保持恒定。

简化的通路：
AKT 简化通路：
AKT（或蛋白激酶 B）在控制存活和凋亡中起着关键作用。这种丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶由胰岛素和各种生长和存活因子调节，在涉及 PI3 激酶的渥曼青霉素敏感通路中起作用。当 AKT 的 Pleckstrin 同源（PH）结构域与磷酸肌醇结合时，AKT 可以被两种不同的激酶磷酸化，PDK1 在苏氨酸 308 位点和 mTORC2（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）在丝氨酸 473 位点，从而开启 AKT 的激活。