以药找靶：TPP（热蛋白质组学）实验服务

以药找靶：TPP（热蛋白质组学）实验服务

一、TPP（热蛋白质组学）技术介绍

TPP(Thermal Proteome Profiling)，即热蛋白质组分析技术，是一种用于研究化合物结合靶点的实验方法。

相较于游离状态下的蛋白质，蛋白质与小分子配体结合形成的复合物，由于氢键等非共价键的协同作用，其热稳定性往往高于游离状态下的蛋白质。经过加热处理后，与配体结合的蛋白质变性沉淀的程度显著低于未结合配体的蛋白质。因此，可通过热处理-高速离心的方法富集可溶性蛋白，并采用高分辨率定量蛋白质组学对差异可溶性蛋白质进行鉴定分析，从而筛选并确认配体的潜在靶标蛋白。

图1 CETSA及TPP变体在天然产物靶点发现中的应用^[2]

二、TPP靶蛋白垂钓技术基本步骤（实验材料以细胞裂解液为例）

1.   细胞裂解，提取总蛋白（注：使用温和的裂解液，保持蛋白活性）。

2.     将化合物或DMSO（对照）与总蛋白孵育，孵育后，化合物会与靶蛋白结合，改变其热稳定性。

3.    孵育完成后，在不同温度下进行热处理，处理完成后，高速离心去除变性沉淀的蛋白质。

4.   将上述蛋白溶液使用胰蛋白酶消化，进行高分辨率质谱鉴定。

图2 TPP实验基本流程图^[1] 

三、案例介绍

Nature commun| TPP结合CETSA、MST、分子对接技术筛选鉴定铜绿假单胞菌代谢物PQS结合靶点^[2] 

1、TPP技术鉴定铜绿假单胞菌代谢物PQS结合受体

为了寻找群体感应分子PQS的结合靶点，作者采取了TPP的实验方法：从RAW264.7细胞中提取总蛋白，并使用BCA试剂盒进行定量，加入5ug/ml（终浓度）PQS或者DMSO（对照）共同孵育5min（37℃），随后在52℃孵育3min，热处理完成后高速离心，取上清进行质谱鉴定。

通过TPP技术，作者发现CNMT是PQS的潜在靶点蛋白。

图3 TPP鉴定PQS潜在蛋白结合靶点

2、CETSA、MST（微量热泳动）、分子对接验证PQS与CNMT的结合

作者首先通过CETSA验证了PQS和CNMT的相互作用，通过在细胞裂解液中加入PQS或DMSO进行孵育，并设置一系列温度梯度（37 ℃、46 ℃、49 ℃、52 ℃、55 ℃、58 ℃）加热，随着温度升高，PQS能提高CNMT的热稳定性（图4A）。

为了定量测量PQS与纯化的CNMT蛋白之间的结合亲和力，研究人员采用了MST微量热泳动技术。MST方法如下：将纯化的人重组His标签CNMT蛋白标记荧光，与不同浓度的PQS配体混合。利用Monolith 系统监测分子在微观温度梯度中的移动，分析归一化荧光值与配体浓度之间的函数关系。MST结果显示：测得PQS与CNMT的KD值为79.68 ±15.34 nM，证实了两者之间存在强力的直接结合（图4B）。

随后使用分子对接（molecular docking）模拟并预测PQS与CNMT结合的位点。MD分子对接结果显示，在PQS-CNMT结合位点中，CNMT的A35残基与PQS形成了氢键，且L32、S34等残基参与了疏水接触（图4C）。

图4 CETSA、MST微量热泳动以及分子对接验证PQS和CNMT相互作用

参考文献

[1]       Mateus A, M??tt? TA, Savitski MM. Thermal proteome profiling: unbiased assessment of protein state through heat-induced stability changes. Proteome Sci. 2017;15:13. Published 2017 Jun 24. doi:10.1186/s12953-017-0122-4

[2]       Tu Y, Tan L, Tao H, Li Y, Liu H. CETSA and thermal proteome profiling strategies for target identification and drug discovery of natural products. Phytomedicine. 2023 Jul 25;116:154862. doi: 10.1016/j.phymed.2023.154862. Epub 2023 May 20. PMID: 37216761.

[3]       Zhang Y, Cao Y, Wu X, et al. Thermal proteome profiling reveals fructose-1,6-bisphosphate as a phosphate donor to activate phosphoglycerate mutase 1. Nat Commun. 2024;15(1):8936. Published 2024 Oct 16. doi:10.1038/s41467-024-53238-w

样品准备要求：

• 细胞要求量：6×10⁷，收集时分装成6管

• 细胞裂解液要求量：蛋白浓度≥2mg/ml，总蛋白量≥6mg，提取总蛋白时分装成3管

• 干冰运输

 标签：靶点鉴定；分子互作；TPP；热蛋白质组学；MST；微量热泳动；CETSA；细胞热迁移；分子对接；

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