丙酮酸激酶(PK)测试盒

商品属性：

商品介绍：

PK（EC 2.7.1.40)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化糖酵解过程中的最后一步反应，是糖酵解过程中的主要限速酶之一，也是产生ATP的关键酶之一，因此测定PK活性具有重要意义。

测定原理

PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸，乳酸脱氢酶进一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和NAD+，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PK活性。

需自备的仪器和用品

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水
检测原理：

核心反应原理（偶联分光光度法）：丙酮酸激酶催化磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP)+ADP 生成丙酮酸 + ATP；体系加入乳酸脱氢酶 (LDH) 作为偶联酶消耗丙酮酸。

靶标反应路径：PEP+ADP\(\xrightarrow{PK}\)丙酮酸 + ATP；丙酮酸 + NADH\(\xrightarrow{LDH}\)乳酸 + NAD⁺。

吸光信号来源：NADH 在 340 nm 有吸收；反应过程 NADH 不断被氧化消耗，340 nm 吸光度下降速率代表 PK 活性高低。

定量计算原理：监测 ΔA340 下降速率；利用 NADH 摩尔消光系数计算每分钟 NADH 消耗量，换算 PK 酶活力。
样本前处理方法：

动植物组织样本取样：按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

细胞/微生物样本收集：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清破碎：按照细菌或细胞数量（10⁴个）:提取液体积(mL)为500~1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

血清/血浆样本

血清(浆)样品：直接检测

食品/饲料样本提取：称取适量样本，加入提取液，振荡提取30min离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

公司正在出售的产品：

测定操作步骤：

比色法/分光光度法操作仪器预热：分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到550nm，蒸馏水调零试剂配制：

试剂二：临用前加入10mL蒸馏水充分乳化备用

试剂三：临用前加入20mL蒸馏水充分溶解备用样本测定：

试剂名称(μL) 空白管 测定管

蒸馏水/样本 100 100

试剂一 700 700

试剂二 100 100

混匀后37℃水浴30min，立即加入试剂三100μL，摇匀，室温放置10min

记录550nm处的吸光值A空白和A测定标准曲线绘制：将油酸标准品稀释成0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL系列浓度，同样处理，测定550nm处的吸光值，绘制标准曲线

荧光法操作仪器预热：荧光分光光度计/酶标仪预热30min以上，设置激发波长355nm，发射波长460nm试剂配制：

试剂二：临用前稀释至合适浓度备用样本测定：

试剂名称(μL) 空白管 测定管

蒸馏水/样本 100 100

试剂一 700 700

试剂二 100 100

混匀后37℃水浴10min，立即测定荧光强度F空白和F测定标准曲线绘制：将荧光标准品稀释成0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μmol/L系列浓度，同样处理，测定荧光强度，绘制标准曲线

ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度