乙酸激酶(ACK)测试盒

商品属性：

商品介绍：

ACK主要存在于微生物中，催化乙酸和ATP生成乙酰磷酸和ADP，是细菌碳代谢和能量代谢的关键酶，尤其是在古细菌甲烷合成代谢中起着中枢作用。

测定原理：

（1)ACK催化乙酸钠和ATP生成乙酰磷酸和ADP，（2)丙酮酸激酶催化ADP和PEP生成ATP和丙酮酸，（3)乳酸脱氢酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+，（4)在340nm下测定NADH氧化生成NAD+速率，即可反映ACK活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水
检测原理：

ACK 催化底物生成乙酰磷酸：乙酸激酶催化乙酸 + ATP 生成乙酰磷酸和 ADP。

偶联丙酮酸激酶‑乳酸脱氢酶反应：生成 ADP 偶联二级酶促反应，消耗 NADH。

NADH 紫外信号衰减：NADH 在 340 nm 有吸收；反应消耗 NADH，OD340 数值随时间下降。

速率法计算活性：监测每分钟 340nm 吸光度下降速率，依据消光系数换算 ACK 酶活力。
样本前处理方法：

‌一、组织样本‌

离体后立即液氮速冻，取0.1g新鲜组织按1:10比例加入预冷提取液。

冰浴条件下充分匀浆，超声破碎30次（功率20%，超声3s/间隔10s）。

8000g 4℃离心10min，取澄清上清置于冰上待测。

‌二、细胞/细菌样本‌

收集500万~1000万细胞，弃去培养基后加入1mL预冷提取液。

冰浴超声破碎，8000g 4℃离心10min，取上清待测。

三、液体样本‌

血清/血浆样本按1:10比例加入提取液，沸水浴振荡提取10min。

10000g常温离心10min，取上清冷却后待测。

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测定操作步骤：

操作仪器预热：将可见分光光度计预热30min，调节波长至540nm，用蒸馏水调零标准曲线绘制：

取6支具塞刻度试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL葡萄糖标准液（10mg/mL）

用蒸馏水补至1.0mL，再加入2.0mL显色工作液，沸水浴5min

立即用流水冷却至室温，定容至25mL，摇匀后测定540nm处吸光值

以葡萄糖浓度（mg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线样本测定：

试剂名称(μL) 空白管 测定管

提取液/样本 100 100

试剂一 700 700

试剂二 100 100

混匀后37℃水浴30min，立即加入2.0mL显色工作液，沸水浴5min

流水冷却至室温，定容至25mL，摇匀后测定540nm处吸光值A空白和A测定