肉桂酸4羟化酶(C4H)测试盒

肉桂酸4羟化酶(C4H)测试盒

产品介绍：

C4H又称反式肉桂酸-4-单氧化酶，多存在于高等植物、酵母、菌类中，该酶催化肉桂酸羟化作用产生4-香豆酸盐，是苯丙烷途径中继L-苯丙氨酸解氨酶之后的第二个关键酶。

测定原理：

C4H催化肉桂酸和NADP生成4-香豆酸盐和NADPH，在340nm下测定NADPH生成速率，即可反映C4H活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

检测原理：

微粒体酶促羟基化反应：C4H 属于细胞色素 P450 单加氧酶，以 NADPH、O₂为辅因子，催化肉桂酸生成 4‑香豆酸。

产物紫外光谱区分：底物肉桂酸和产物 4‑香豆酸最大吸收波长存在差异，产物积累改变反应液 OD。

终止反应萃取产物：孵育一段时间后加入终止液停止酶促反应，有机溶剂萃取芳香产物。

比色或色谱定量换算酶活：对照 4‑香豆酸标准曲线，计算单位时间产物生成量，得到 C4H 活性。
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操作步骤：

操作仪器预热：将可见分光光度计预热30min，调节波长至540nm，用蒸馏水调零标准曲线绘制：

取6支具塞刻度试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL葡萄糖标准液（10mg/mL）

用蒸馏水补至1.0mL，再加入2.0mL显色工作液，沸水浴5min

立即用流水冷却至室温，定容至25mL，摇匀后测定540nm处吸光值

以葡萄糖浓度（mg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线样本测定：

试剂名称(μL) 空白管 测定管

提取液/样本 100 100

试剂一 700 700

试剂二 100 100

混匀后37℃水浴30min，立即加入2.0mL显色工作液，沸水浴5min

流水冷却至室温，定容至25mL，摇匀后测定540nm处吸光值A空白和A测定