牛免疫缺损病毒PCR检测试剂盒 新品

本试剂盒基于实时荧光PCR技术，特异性靶向牛免疫缺损病毒特征基因序列，可精准检测牛外周血淋巴细胞、血浆、淋巴组织等样本中的病毒核酸。该病毒易引发牛群免疫功能低下、继发多重感染，试剂盒凭借超高灵敏度可早期检出潜伏感染、无症状携带样本，有效弥补传统检测方法的滞后性。适用于牛群引种检疫、种群净化、隐性感染筛查及牛免疫缺陷相关疫病的病因溯源与流行病学研究。

基础原理：

样本病毒 RNA 经反转录生成 cDNA，引物靶向病毒 gag 核心蛋白基因，荧光定量 PCR 扩增，根据荧光 Ct 值判定牛免疫缺损病毒感染。

巢式 RT-PCR 分两轮扩增，第一轮扩增慢病毒同源片段，第二轮特异性扩增牛免疫缺损病毒特有序列，极低病毒载量样本精准检出。

SYBR Green 熔解曲线分析法 RT-PCR，扩增病毒逆转录酶基因，通过特征熔解温度排除牛其他慢病毒交叉阳性干扰。

‌操作步骤‌：

（一）反应体系配制（冰上操作，防酶失活与污染）

按 “水→缓冲液→dNTP→引物→模板→Taq 酶” 顺序加样（酶最后加，避免失活）。

轻轻涡旋混匀，短暂离心（3000rpm，10s），使液体沉至管底。

无热盖的 PCR 仪：加 1 滴矿物油覆盖液面，防止蒸发。

（二）PCR 程序设置（标准 35 循环）

预变性：94℃，3-5min（彻底变性模板 DNA）。

循环阶段（35 次）：

变性：94℃，30s（双链解链）。

退火：55-65℃，30s（引物结合模板，按引物 Tm 值调整）。

延伸：72℃，1min/kb（Taq 酶合成新链，1kb 片段约 1min）。

终延伸：72℃，5-10min（确保片段完整延伸）。

保温：4℃，∞（防止非特异性复性，短期保存）。

（三）产物检测（琼脂糖凝胶电泳）

制胶：1% 琼脂糖凝胶（1g 琼脂糖 + 100mL 1×TAE 缓冲液），加热融化后加核酸染料，倒胶插梳，凝固 30min。

上样：取 5μL PCR 产物 + 1μL 上样缓冲液，点样；同时加 DNA Marker（分子量对照）。

电泳：120V，20-30min，至溴酚蓝迁移至凝胶 2/3 处。

成像：凝胶成像系统观察条带，目标片段位置与预期一致则为阳性。

四、参数优化

退火温度（Tm）：引物 Tm 值 = 4×(G+C)+2×(A+T)，退火温度一般低于 Tm 值 5℃，温度过高无条带，过低非特异性条带多。

Mg²⁺浓度：1.5-2.5mM，浓度过低酶活性低、产量少；过高非特异性扩增增加。

循环数：25-35 个循环，少于 25 个产物不足，多于 35 个易出现非特异性条带。

延伸时间：按目标片段长度调整，≤1kb 用 1min，1-3kb 用 2-3min。

‌注意事项‌：

分区操作：试剂配制、样品处理、PCR扩增需在独立区域进行，避免交叉污染

无菌操作：使用带滤芯枪头、一次性手套和专用工作服

试剂准备：所有试剂使用前需完全融化，震荡混匀后短暂离心

避光保存：含荧光探针的试剂需避光保存和操作

防止污染：阳性对照操作需最后进行，实验后用10%次氯酸或75%酒精消毒工作台

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