人肾病蛋白(nephrin)ELISA试剂盒

本试剂盒基于双抗体夹心ELISA技术原理，将人肾病蛋白(nephrin)特异性抗体包被于96孔微孔板固相表面，加入待测样本和梯度标准品，样本中的nephrin抗原与固相抗体特异性免疫结合，洗涤去除未结合杂质后，加入辣根过氧化物酶标记的nephrin抗体，形成稳定夹心免疫复合物，底物显色后通过终止液终止反应，酶标仪读取特定波长吸光度，吸光度数值与样本中nephrin浓度成正比，可通过标准曲线计算样本靶标含量。
产品参数：

‌灵敏度：最低可测 1.1ng/L

检测范围：6ng/L ~ 780ng/L

反应时间：样本孵育 60min，二抗结合 48min，底物显色 19min，总用时 2h07min

保存条件：全套试剂 2~8℃避光，浓缩洗涤液结晶后温水浴溶解即可正常使用

显色系统：预装单组分 TMB 显色试剂，2mol/L 硫酸终止

检测波长：450nm 单波长检测

标准曲线绘制：线性最小二乘法回归绘制曲线，设置 6 个梯度标准品

注意事项：尿液样本需离心取上清，蛋白尿浑浊样本需过滤预处理；加样时避免交叉污染孔间液体
实验前准备工作：

1. 试剂平衡与稀释

试剂盒所有组分（酶标板、标准品、酶结合物、底物、洗涤浓缩液、样本稀释液、终止液）从 2~8℃取出，室温（20~25℃）放置平衡 30min，严禁直接低温操作。

浓缩洗涤液配制：按标签标注比例用去离子纯水稀释（常见 20× 浓缩液：1 份浓缩液 + 19 份纯水），混匀备用，现配现用。

标准品复溶 / 梯度稀释：

冻干标准品加入配套标准品稀释液充分溶解，室温静置 10min，轻柔吹打混匀；

按说明书梯度倍比稀释出 5~7 个浓度梯度标准品，单独标记，剩余原液分装 - 20℃避光保存，避免反复冻融。

待测样本预处理：血清 / 血浆、组织匀浆、细胞上清用样本稀释液适当稀释，浑浊样本 12000r/min 离心 10min 取上清；溶血、脂血严重样本弃用。

2. 耗材与设备准备

设备：恒温 37℃孵育箱、酶标仪（450nm 主波长，630nm 参比）、多通道移液枪、吸水滤纸、洗板机（或手动洗板槽）、封板膜、离心管。

耗材无核酸酶、无热源、无蛋白污染，移液枪提前校准。

取出本次实验所需酶标板条，剩余未使用板条装入铝箔密封袋，加干燥剂 2~8℃避光保存。

3. 孔位规划标记

酶标板做好分区标记：空白孔、零标准孔、梯度标准品孔、待测样本孔、复孔（所有样本、标准品建议设置双复孔降低误差）。

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实验操作流程：

试剂盒组分室温复温 26min，稀释浓缩洗涤液，倍比稀释 nephrin 标准品，标记酶标板孔类型。

标准品孔加入 50μL 梯度标准溶液；待测孔加 50μL 稀释液 + 10μL 样本；空白孔空置。

全部检测孔加入 HRP 标记抗 nephrin 抗体 100μL，封板，37℃孵育 58min。

倒掉孔内废液，洗涤液加满每孔静置 40s，甩干，洗板 4 次，充分拍干微孔板。

每孔加显色 A、B 液各 50μL，混匀后 37℃避光显色 17min。

加入 50μL 终止液混匀终止反应。

酶标仪 450nm 读值，拟合标准曲线，计算样本肾病蛋白含量。