异柠檬酸裂解酶(ICL)测试盒

商品属性：

商品介绍：

ICL（EC4.1.3.1)主要存在于植物和微生物中，油料作物种子在萌发过程中，通过乙醛酸循环及其他过程将脂肪转变成碳水化合物。ICL是乙醛酸循环的关键酶之一。

测定原理：

ICL催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD，NADH在340nm下有特征吸收峰，监测340nm吸光度的减小速率可间接反应ICL活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水
检测原理：

裂解反应：ICL催化异柠檬酸裂解为琥珀酸和乙醛酸

显色反应：乙醛酸与苯肼反应生成苯腙，在324nm波长下有特征吸收峰

活性计算：通过测定324nm波长下吸光度的变化率计算ICL活性

乙醛酸循环：ICL是乙醛酸循环的关键酶，参与微生物和植物的脂肪代谢
样本前处理方法：

植物组织样本取样：称取0.1g样本，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆离心：11000g，4℃离心10min，弃沉淀取上清，置冰上待测

血清/血浆样本采集：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20°C，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻处理：直接检测。

细胞/微生物样本收集：先收集微生物或细胞到离心管内，离心后弃上清破碎：按照微生物或细胞数量（10⁴个）:提取液体积(mL)为500~1000:1的比例（建议500万微生物或细胞加入1mL提取液），超声波破碎微生物或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

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测定操作步骤：

标准曲线绘制：

取6支试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准系列溶液，补加提取液至1mL。

每管加入2mL底物缓冲液，37℃水浴预热5分钟。

加入0.5mL显色剂，混匀后37℃水浴准确反应10分钟。

立即加入2mL终止液终止反应，于405nm波长下测定吸光度，以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

样本检测：

取1mL待测样本（若样本活性过高，需用提取液稀释），加入2mL底物缓冲液，37℃水浴预热5分钟。

加入0.5mL显色剂，混匀后37℃水浴准确反应10分钟。

立即加入2mL终止液终止反应，于405nm波长下测定吸光度，根据标准曲线计算样本中β-GAL活性。

微量酶标仪法操作步骤

加样：在96孔板中设置空白孔、标准孔、样本孔，每孔加50μL对应溶液。

反应：每孔加入100μL底物缓冲液，37℃孵育30分钟。

终止：每孔加入50μL终止液。

读数：用酶标仪在405nm波长下测定吸光度，计算酶活性。