线粒体呼吸链复合体Ⅲ/CoQ细胞色素C还原酶测试盒

线粒体呼吸链复合体Ⅲ/CoQ细胞色素C还原酶测试盒

产品介绍：

线粒体复合体Ⅲ（EC 1.10.2.2）又称CoQ-细胞色素C还原酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责把还原型CoQ的氢传递给细胞色素C，生成还原型细胞色素C。

测定原理：

与氧化型细胞色素C不同，还原型细胞色素C在550nm有特征光吸收，因此550nm光吸收增加速率能够反映线粒体复合体Ⅲ酶活性。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

检测原理：

电子传递催化反应：复合体 Ⅲ 催化还原型辅酶 Q（CoQH₂）氧化，将电子传递给氧化型细胞色素 C，生成还原型细胞色素 C。

还原型细胞色素 C 比色原理：还原态细胞色素 C 在 550 nm 具有特征吸收峰，测定 550 nm 吸光度上升速率反映复合体 Ⅲ 活性。

抗霉素 A 抑制对照原理：抗霉素 A 特异性阻断复合体 Ⅲ 电子传递，抑制管与活性管速率之差排除其他还原酶干扰信号。

消光系数计算原理：使用细胞色素 C 摩尔消光系数，将每分钟吸光度增量换算成每分钟被还原的细胞色素 C 物质的量，计算酶活。
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操作步骤：

比色法/分光光度法/微量法操作仪器预热：可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到500nm/550nm，蒸馏水调零试剂配制：

试剂二：临用前加入1.5mL蒸馏水充分溶解备用

试剂三：临用前加入1.5mL蒸馏水充分溶解备用样本测定：

试剂名称(μL) 空白管 测定管

蒸馏水/样本 100 100

试剂一 700 700

试剂二 100 100

试剂三 100 100

混匀后37℃水浴10min，记录500nm/550nm处的吸光值A空白和A测定标准曲线绘制：将PLD标准品稀释成0、1、2、3、4、5U/L系列浓度，同样处理，测定500nm/550nm处的吸光值，绘制标准曲线

ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度