海藻糖酶测试盒

商品属性：

商品介绍：

THL（EC 3.2.1.28）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。海藻糖酶主要功能在于生物体分解海藻糖生成葡萄糖而直接用于能量供应。

测定原理：

采用3.5－二硝基水杨酸法测定THL催化海藻糖产生的还原糖的含量。还原糖与3.5－二硝基水杨酸共热生成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比，由此判断THL活性的高低。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
检测原理：

专一水解反应：海藻糖酶特异性切断海藻糖糖苷键，1 分子海藻糖水解生成 2 分子葡萄糖。

终止酶促反应：沸水浴加热终止酶催化反应，避免产物继续变化。

葡萄糖氧化酶显色检测：生成葡萄糖在 GOD‑POD 显色体系下产生有色产物。

标准曲线定量：505 nm 测 OD，葡萄糖生成速率代表海藻糖酶活性。
样本前处理方法：

细菌或培养细胞样本收集：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清破碎：按照细菌或细胞数量（10⁴个）:提取液体积(mL)为500~1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

组织样本取样：按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取约0.05g组织，加入0.5mL提取液），进行冰浴匀浆离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

血清/血浆样本

血清(浆)样品：直接检测

土壤样本取样：将样本风干、粉碎、过40目筛，然后称取约0.5g、加入2mL提取液（甲苯）提取：震荡提取20min，12000rpm，4℃，离心20min，取上清待测

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测定操作步骤：

比色法/分光光度法/微量法操作仪器预热：可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到500nm/550nm，蒸馏水调零试剂配制：

试剂二：临用前加入1.5mL蒸馏水充分溶解备用

试剂三：临用前加入1.5mL蒸馏水充分溶解备用样本测定：

试剂名称(μL) 空白管 测定管

蒸馏水/样本 100 100

试剂一 700 700

试剂二 100 100

试剂三 100 100

混匀后37℃水浴10min，记录500nm/550nm处的吸光值A空白和A测定标准曲线绘制：将PLD标准品稀释成0、1、2、3、4、5U/L系列浓度，同样处理，测定500nm/550nm处的吸光值，绘制标准曲线

ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度