硫氧还蛋白氧化还原酶(TrxR)测试盒

商品属性：

商品介绍：

TrxR是一种NADPH依赖的包含FAD结构域的二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员，与硫氧还蛋白以及NADPH共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR与GR活性类似，催化GSSG还原生成GSH，是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。

测定原理：

TrxR催化NADPH还原DTNB生成TNB和NADP+，TNB在412 nm有特征吸收峰，通过测定412nm波长处TNB的增加速率，即可计算TrxR活性。

自备仪器和用品：

低温离心机、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸馏水。
检测原理：

还原酶催化原理：TrxR 以 NADPH 为电子供体，催化氧化型硫氧还蛋白 (Trx‑S₂) 还原。

辅酶消耗信号原理：NADPH 被氧化，340 nm 吸光度随反应下降；也可选用 DTNB 显色体系。

动力学分光检测原理：读取 340nm 吸光度下降速率表征 TrxR 活性。

抑制剂对照原理：添加 TrxR 特异性抑制剂对照管，扣除其他 NADPH 氧化酶带来的背景干扰。
样本前处理方法：

细菌或培养细胞样本收集：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清破碎：按照细菌或细胞数量（10⁴个）:提取液体积(mL)为500~1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

组织样本取样：按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取约0.05g组织，加入0.5mL提取液），进行冰浴匀浆离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

血清/血浆样本

血清(浆)样品：直接检测

土壤样本取样：将样本风干、粉碎、过40目筛，然后称取约0.5g、加入2mL提取液（甲苯）提取：震荡提取20min，12000rpm，4℃，离心20min，取上清待测

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测定操作步骤：

比色法/分光光度法/微量法操作仪器预热：可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到500nm/550nm，蒸馏水调零试剂配制：

试剂二：临用前加入1.5mL蒸馏水充分溶解备用

试剂三：临用前加入1.5mL蒸馏水充分溶解备用样本测定：

试剂名称(μL) 空白管 测定管

蒸馏水/样本 100 100

试剂一 700 700

试剂二 100 100

试剂三 100 100

混匀后37℃水浴10min，记录500nm/550nm处的吸光值A空白和A测定标准曲线绘制：将PLD标准品稀释成0、1、2、3、4、5U/L系列浓度，同样处理，测定500nm/550nm处的吸光值，绘制标准曲线

ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度