硝酸还原酶(NR)测试盒(NADH速率法)

商品属性：

商品介绍：

NR（ EC 1.7.1.3)广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。

测定原理

NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3ˉ +NADH+H＋→ NO2ˉ +NAD＋ +H 2 O；NADH在 340 nm 有最大吸收峰，通过测定NADH减少速率来表示NR活性。

需自备的仪器和用品

酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
检测原理：

硝酸还原酶可催化底物硝酸根（NO₃⁻），以 NADH 作为电子供体，将硝酸根还原生成亚硝酸根（NO₂⁻）。

反应体系中 NADH 在 340 nm 处有特征吸收峰，随着酶促反应进行 NADH 被不断氧化消耗，OD340 数值持续下降。

通过分光光度计连续监测单位时间内 340 nm 吸光度下降速率，反映 NADH 消耗速度，间接换算硝酸还原酶活性。

设置空白对照扣除样本本身底色干扰、非特异性氧化造成的 NADH 损耗，最终计算得到样本 NR 酶活力。
样本前处理方法：

细菌或培养细胞样本收集：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清破碎：按照细菌或细胞数量（10⁴个）:提取液体积(mL)为500~1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

组织样本取样：按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取约0.05g组织，加入0.5mL提取液），进行冰浴匀浆离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

血清/血浆样本

血清(浆)样品：直接检测

土壤样本取样：将样本风干、粉碎、过40目筛，然后称取约0.5g、加入2mL提取液（甲苯）提取：震荡提取20min，12000rpm，4℃，离心20min，取上清待测

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测定操作步骤：

比色法/分光光度法/微量法操作仪器预热：可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到500nm/550nm，蒸馏水调零试剂配制：

试剂二：临用前加入1.5mL蒸馏水充分溶解备用

试剂三：临用前加入1.5mL蒸馏水充分溶解备用样本测定：

试剂名称(μL) 空白管 测定管

蒸馏水/样本 100 100

试剂一 700 700

试剂二 100 100

试剂三 100 100

混匀后37℃水浴10min，记录500nm/550nm处的吸光值A空白和A测定标准曲线绘制：将PLD标准品稀释成0、1、2、3、4、5U/L系列浓度，同样处理，测定500nm/550nm处的吸光值，绘制标准曲线

ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度