3-磷酸甘油酸激酶(PGK)测试盒

                                      3-磷酸甘油酸激酶(PGK)测试盒
产品介绍：

3-磷酸甘油酸激酶(PGK)是糖酵解的关键酶，广泛存在于动植物和微生物体内，催化 3-磷酸甘油酸和 ATP 反应产生 1,3-二磷酸甘油酸，后者在 3-磷酸甘油醛脱氢酶和 NADH 作用下产生 3-磷酸甘油醛和 NAD+，通过测定 NADH 的下降量，进而得到 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)的活性大小。

所需实验用品：

酶标仪、96 孔板、可调式移液器、天平、低温离心机

检测原理：

一、核心反应基础

PGK特异性催化糖酵解中的可逆底物水平磷酸化反应：以3-磷酸甘油酸和ATP为底物，生成1,3-二磷酸甘油酸
和ADP，这是糖酵解通路中衔接上下游反应的核心步骤。

二、偶联指示反应

生成的1,3-二磷酸甘油酸会在体系内偶联的3-磷酸甘油醛脱氢酶作用下，与NADH发生反应，生成3-磷酸甘油
醛、NAD⁺和无机磷酸。

三、信号定量逻辑

NADH在340nm紫外波长下有特征吸收峰，而其氧化产物NAD⁺在该波长下无吸收。通过紫外分光光度计持续
监测340nm处的吸光度下降速率，即可直接量化NADH的氧化速率，进而换算得到PGK的真实活性。

四、方法优势

该酶偶联速率法可特异性排除1,3-二磷酸甘油酸、3-磷酸甘油酸、ADP等杂代谢物的干扰，无需复杂样本纯化
步骤，适配动物组织、细胞、微生物等多种样本类型，检测灵敏度和重复性表现优异。
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操作步骤：

一、实验前准备

1‌、试剂预处理‌

提前将所有冷冻试剂从-20℃取出解冻，冷藏试剂室温平衡至25℃。

按说明书指定体积，分别将各粉剂试剂用蒸馏水充分溶解，混匀后分装，剩余部分-20℃冻存，禁止反复冻融。

‌2、仪器校准‌

紫外分光光度计提前预热30min，校准340nm波长，设置反应温度25℃，用蒸馏水完成空白调零。

准备好1cm光径的石英比色皿、校准过的移液器、无菌吸头、冰浴装置。

‌预实验验证‌

选取2~3个预期活性差异较大的样本做预测定，确认样本浓度在检测线性范围内，避免试剂浪费。

二、样本前处理

‌1、总PGK酶提取‌

称取约0.1g样本，加入1ml预冷提取液，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min）。

4℃、500g条件下离心5min，取上清置于冰上待测。

‌2、胞浆与叶绿体PGK酶分离提取‌

按植物组织质量(g):提取液体积(ml)=1:5~10的比例，冰浴匀浆后4℃、500g离心5min，弃沉淀。

上清继续4℃、8000g离心10min，取上清测定胞浆PGK活性，沉淀加1ml提取液震荡溶解后超声破碎，4℃、500g离心5min，取上清测定叶绿体PGK活性。