节瘤拟杆菌PCR检测试剂盒

本试剂盒依托PCR分子扩增技术，靶向扩增节瘤拟杆菌特异性基因片段，可对畜禽养殖环境、动物样本中的节瘤拟杆菌进行定性检测。产品体系稳定、抗干扰能力强，可快速完成病原筛查，解决传统微生物检测周期长的问题，适用于畜牧养殖疫病监测、畜禽口腔及消化道感染病原诊断、养殖环境微生物防控。

基础原理：

引物针对节瘤拟杆菌 nuoN 基因特有片段设计，特异性识别该牛羊腐蹄病致病菌。

从动物蹄部病灶组织提取细菌 DNA，经 PCR 热循环扩增富集目标病原菌核酸。

通过阳性菌株扩增条带比对结果，快速完成节瘤拟杆菌感染的分子诊断。

‌操作步骤‌：

DNA提取（样本制备区）

使用自选方法或兼容的核酸提取试剂盒纯化样本DNA，确保无抑制剂残留。

标准曲线制备（样本制备区）

标记6支离心管为7至2号，每管加入45 μL DEPC-H2O（需使用带滤芯枪头）。

梯度稀释阳性对照：

7号管：加入5 μL 1×10^8拷贝/μL阳性对照，震荡混匀，得1×10^7拷贝/μL标准品；

依次稀释至2号管，最终浓度跨5个数量级（1×10^7至1×10^3拷贝/μL）。

所有标准品置于冰上备用，避免反复冻融。

试剂配制（试剂准备区）

反应液避光解冻后涡旋混匀，短暂离心分装至PCR管。

每反应体系20 μL，含预混引物、荧光染料及缓冲液。

加样（样本处理区）

分别加入5 μL待测DNA或标准品至反应管，阴性对照以DEPC-H2O替代。

盖紧管盖，避免气泡干扰。

PCR扩增（核酸扩增区）

按以下程序运行定量PCR仪：

预变性：95℃ 2分钟；

循环阶段（40次）：95℃ 15秒 → 60℃ 30秒（采集荧光信号）；

熔解曲线分析（可选）。

‌注意事项‌：

所有试剂避免反复冻融，可分装小体积冻存；融化后冰上放置不超过 2 h，酶失活会直接导致无扩增条带

阳性质粒拷贝数极高，开盖全程在生物安全柜操作，防止气溶胶污染实验室

所有耗材必须无核酸酶，枪头一次性使用；实验后 PCR 管、废液 121℃高压灭菌后丢弃

试剂盒出现浑浊、变色、结冰分层、过期禁止使用

仅限科研检测，严禁用于人体临床疾病诊断、食品出厂检疫等合规检测场景

土壤、粪便、腐殖质样本优先使用磁珠法提取核酸，减少抑制剂干扰

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