丙酸杆菌通用PCR检测试剂盒

本试剂盒针对丙酸杆菌属通用保守基因设计广谱引物，可全覆盖丙酸杆菌属各类菌种核酸检测，实现属级快速筛查，无需逐一分型检测。试剂盒扩增体系稳定，抗样本干扰能力强，与其他皮肤、组织致病菌无交叉反应，适配性广。主要用于畜禽丙酸杆菌群体性感染筛查、皮肤及软组织感染病原初诊、微生物群落分析及相关病原流行病学调研。

基础原理：

提取皮肤样本所有细菌总 DNA，去除皮脂等干扰成分。

引物结合丙酸杆菌属保守核酸序列，可检出属内多种丙酸杆菌。

通过荧光扩增信号判断样本是否存在丙酸杆菌属细菌。

‌操作步骤‌：

DNA提取（样本制备区）

使用自选方法或兼容的核酸提取试剂盒纯化样本DNA，确保无抑制剂残留。

标准曲线制备（样本制备区）

标记6支离心管为7至2号，每管加入45 μL DEPC-H2O（需使用带滤芯枪头）。

梯度稀释阳性对照：

7号管：加入5 μL 1×10^8拷贝/μL阳性对照，震荡混匀，得1×10^7拷贝/μL标准品；

依次稀释至2号管，最终浓度跨5个数量级（1×10^7至1×10^3拷贝/μL）。

所有标准品置于冰上备用，避免反复冻融。

试剂配制（试剂准备区）

反应液避光解冻后涡旋混匀，短暂离心分装至PCR管。

每反应体系20 μL，含预混引物、荧光染料及缓冲液。

加样（样本处理区）

分别加入5 μL待测DNA或标准品至反应管，阴性对照以DEPC-H2O替代。

盖紧管盖，避免气泡干扰。

PCR扩增（核酸扩增区）

按以下程序运行定量PCR仪：

预变性：95℃ 2分钟；

循环阶段（40次）：95℃ 15秒 → 60℃ 30秒（采集荧光信号）；

熔解曲线分析（可选）。

‌注意事项‌：

分区操作：试剂配制、样品处理、PCR扩增需在独立区域进行，避免交叉污染

无菌操作：使用带滤芯枪头、一次性手套和专用工作服

试剂准备：所有试剂使用前需完全融化，震荡混匀后短暂离心

避光保存：含荧光探针的试剂需避光保存和操作

防止污染：阳性对照操作需最后进行，实验后用10%次氯酸或75%酒精消毒工作台

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