ATCC 9372枯草芽孢杆菌黑色变种灭菌

导读： 干热灭菌和环氧乙烷（EO）灭菌是医疗器械和制药工业中两种重要的灭菌方式，而ATCC 9372（枯草芽孢杆菌黑色变种）正是验证这两种灭菌工艺效果的标准生物指示剂菌株。与高压蒸汽灭菌使用的嗜热脂肪芽孢杆菌（ATCC 7953）不同，ATCC 9372的芽孢在160°C干热和EO气体中表现出标准化的耐热性，是灭菌验证体系中不可替代的参考菌株。

菌株基本信息

ATCC 9372的学名为 Bacillus atrophaeus（旧称 Bacillus subtilis var. niger，即枯草芽孢杆菌黑色变种）。2000年基于16S rRNA和DNA-DNA杂交分析，该菌从枯草芽孢杆菌复合种中独立为新种——萎缩芽孢杆菌（B. atrophaeus）。"黑色变种"这一旧称源于该菌在含酪氨酸的培养基上产生黑色素样色素的特性。

| 项目 | 内容 |

|------|------|

| 学名 | Bacillus atrophaeus（旧称 Bacillus subtilis var. niger） |

| ATCC编号 | 9372 |

| 生物安全等级 | BSL-1 |

| 推荐培养基 | TSA、TSB |

| 最适生长温度 | 30-37°C |

| 干热D₁₆₀值 | 1.0-2.5分钟 |

| EO D₆₀₀mg/L值 | 2.5-5.8分钟 |

| 芽孢数要求 | ≥10⁶ CFU/载体 |

生物学特性与形态

ATCC 9372为革兰阳性杆菌（0.7-0.8 × 2-3 μm），在TSA上37°C培养24小时后，菌落大、不规则、表面粗糙、乳白色至浅棕色。该菌可形成中央或偏端的椭圆形芽孢，芽孢壁厚且致密，具有极强的抗逆性。

与ATCC 19404的区别

在实际工作中，ATCC 9372和ATCC 19404经常被提及，两者的关系需要厘清：

• ATCC 9372 = Bacillus atrophaeus（萎缩芽孢杆菌），专用于干热灭菌和EO灭菌的生物指示剂

• ATCC 19404 = Bacillus subtilis subsp. spizizenii（枯草芽孢杆菌斯氏亚种），用于消毒效果检测和培养基质控

两者虽同属枯草芽孢杆菌复合种，但分类学上属于不同的种，耐热特性和应用场景也不同。不可混用。

芽孢耐热特性

ATCC 9372芽孢的耐热性特征：

干热： D₁₆₀ = 1.0-2.5分钟。干热灭菌的杀灭机制主要是蛋白质氧化和DNA损伤，与湿热灭菌的蛋白质凝固机制不同。干热需要更高的温度和更长的时间才能达到与湿热相当的杀灭效果——这就是为什么干热灭菌参数通常为160°C/2小时或170°C/1小时。

环氧乙烷： D₆₀₀mg/L = 2.5-5.8分钟（在30°C、60% RH条件下）。EO灭菌的杀灭机制是烷基化反应——EO分子与芽孢蛋白质和DNA上的活性基团（-NH₂、-SH、-OH、-COOH）发生烷基化反应，导致生物大分子失活。

培养条件与操作要点

芽孢制备

ATCC 9372的芽孢制备与ATCC 7953类似，但培养温度为30-37°C（非55-60°C），培养时间为5-7天。芽孢成熟后同样需要热激处理（80°C/10分钟）去除营养体。

载体类型

干热灭菌BI载体： 通常为不锈钢片或铝片（6mm × 30mm或类似规格），载有≥10⁶个ATCC 9372芽孢。不锈钢载体可耐受160°C以上的高温。

EO灭菌BI载体： 通常为滤纸条（10mm × 50mm）或玻璃纤维纸，载有≥10⁶个芽孢。滤纸载体便于EO气体穿透，更接近实际灭菌条件。

在各标准中的应用

USP中的应用

USP<1035>： 明确指定 Bacillus atrophaeus 作为干热灭菌（dry heat sterilization）和环氧乙烷灭菌（ethylene oxide sterilization）的生物指示剂菌株。

ISO标准中的应用

ISO 11138-3:2017（湿热灭菌）： 虽然该部分主要针对湿热灭菌，但ISO 11138系列中：

ISO 11138-4:2017（干热灭菌用生物指示剂）： 指定 B. atrophaeus 作为干热灭菌BI，要求D₁₆₀ ≥ 1.0分钟。

ISO 11135:2014（医疗器械环氧乙烷灭菌）： 规定使用 B. atrophaeus 芽孢作为EO灭菌验证的生物指示剂。

中国药典与GB标准

中国药典2020版通则1431： 引用枯草芽孢杆菌黑色变种（B. atrophaeus）作为干热和EO灭菌的生物指示剂。

GB 18281.4-2015（干热灭菌用生物指示物）： 等同采用ISO 11138-4。

GB 18279-2022（医疗器械环氧乙烷灭菌）： 等同采用ISO 11135。

干热灭菌验证

灭菌参数

干热灭菌的常用参数：

• 160°C/2小时（120分钟）

• 170°C/1小时（60分钟）

• 180°C/30分钟

F_H值（等效干热灭菌时间）以170°C为参考温度，z=20°C计算。

BI放置与判读

BI放置在干热灭菌器中最难加热的位置（通常为装载中心或远离热源处）。灭菌后取出BI，在TSB中37°C培养7天（或按产品说明书时间）。培养基浑浊 = 灭菌不合格；培养基清亮 = 灭菌合格。

干热灭菌的BI培养时间比湿热灭菌更长（7天 vs 48小时），这是因为干热对芽孢的杀灭是"部分杀灭"模式——存活芽孢可能受到亚致死损伤，需要更长时间才能恢复生长。

环氧乙烷灭菌验证

灭菌参数

EO灭菌的核心参数包括：

• EO浓度：450-1200 mg/L（常用600 mg/L）

• 温度：37-63°C（常用54°C）

• 相对湿度：40-80%（常用60%）

• 暴露时间：1-6小时

• 通气解析时间：8-12小时（去除残余EO）

半周期法（Half-Cycle Method）

EO灭菌验证通常采用半周期法：

1. 最短暴露时间测定： 确定在特定条件下杀灭所有BI芽孢所需的最短时间

2. 半周期设定： 将最短暴露时间的一半设定为日常灭菌的暴露时间

3. 验证： 在半周期条件下，所有BI应呈阴性

这种方法通过数学模型确保灭菌工艺具有足够的安全裕度。

BI判读

灭菌后的BI在TSB中37°C培养7天。与干热灭菌类似，EO灭菌的BI培养时间也较长，因为EO对芽孢的烷基化损伤可能导致亚致死状态，恢复生长需要更长时间。

菌种保藏与管理

管理规范与ATCC 7953类似。芽孢悬液4°C保存可维持活性12-24个月。载体BI按产品说明书条件保存（通常室温，避光，远离化学蒸汽）。

注意：EO灭菌用BI载体（滤纸条）对湿气敏感，保存时应密封防潮，否则芽孢的EO抗性可能发生变化。

安全注意事项

BSL-1级别。枯草芽孢杆菌黑色变种对人体无致病性，操作安全性高。基本的无菌操作规范即可满足要求。

常见问题与工程师建议

Q1：干热灭菌BI培养7天后培养基仍然清亮，是否可以报告灭菌合格？

是的。按照ISO 11138-4和USP<1035>的要求，干热灭菌BI的培养时间为7天（部分产品可能标注14天）。7天后培养基清亮即判为阴性（合格）。如果培养时间缩短（如只培养2-3天），可能漏检受到亚致死损伤的芽孢，导致假阴性。

Q2：EO灭菌后BI阳性，但EO浓度和暴露时间都在参数范围内，如何排查？

常见原因：1）预调湿不充分——EO灭菌对湿度敏感，芽孢在低湿度下的EO抗性显著升高，确认RH达到60%±10%；2）BI放置在EO气体最难穿透的位置（如包装内部深处）；3）EO吸收不良——装载过密影响气体循环。建议检查预调湿参数、BI放置位置和装载模式。

Q3：为什么湿热灭菌用嗜热菌（ATCC 7953），而干热/EO灭菌用常温菌（ATCC 9372）？

这与灭菌机制有关。湿热灭菌在121°C下进行，嗜热菌的芽孢在这种温度下表现出标准化的耐热性（D₁₂₁ = 1.5-3.0 min）。干热灭菌在160-180°C下进行，嗜热菌在如此高的温度下芽孢会迅速被杀灭（D值太短，无法提供有效的验证时间窗口），而枯草芽孢杆菌黑色变种的芽孢在160°C下的D值（1.0-2.5 min）更适合作为干热验证的参考。EO灭菌同理：常温芽孢在EO条件下的D值范围更适合作为验证标准。

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免责声明： 本文所述菌株信息及技术参数均来源于ATCC官网、美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、《中国药典》2020年版、ISO 11138标准、ISO 11135标准及GB 18281/GB 18279标准等公开权威资料，仅供专业技术参考。具体实验操作请以产品随附的质检报告(COA)和说明书为准，并严格遵守所在机构的生物安全管理制度。本文不构成任何产品推荐或使用建议。

关键词标签: ATCC 9372, 枯草芽孢杆菌黑色变种, Bacillus atrophaeus, 干热灭菌, 环氧乙烷灭菌, 生物指示剂, D值, ISO 11138, ISO 11135, USP 1035