ATCC 6633枯草芽孢杆菌：抗生素效价测定与药敏试验的标准菌株

在制药企业的微生物实验室里，抗生素效价测定是一项日常且关键的质控工作，标准菌株的选择直接决定了检测结果的可靠性。ATCC 6633（Bacillus subtilis subsp. subtilis）是国际上广泛用于抗生素效价测定和药敏试验的模式菌株，被USP、EP及《中国药典》多部权威标准收录。本文结合实际工作经验，对该菌株的基本信息、培养要点及应用场景做一梳理，供同行参考。

菌株基本信息

ATCC 6633的分类学名称为Bacillus subtilis subsp. subtilis，即枯草芽孢杆菌枯草亚种。该菌株在ATCC保藏中心的编号为6633，同时也被称为NRS 231（Northern Regional Research Laboratory的保藏编号）。其原产地为美国（USA），生物安全等级为BSL-1，属于对人及环境危害极低的一类微生物。

在菌种目录中，ATCC 6633的推荐培养基包括Mueller-Hinton（MH）培养基、胰酪大豆胨液体培养基(TSB)及胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)。推荐培养温度为30°C，这一点对日常操作至关重要——很多同行习惯性地使用37°C培养所有细菌，但对于这株菌而言，30°C才是其最适生长温度。当然，它在37°C条件下也能生长，只是生理状态和芽孢形成效率会有所不同。

生物学特性与形态

ATCC 6633为革兰阳性杆菌（Gram-positive rod），在显微镜下呈直杆状或短链状排列。该菌具有运动性（motile），周身生有鞭毛。作为一个典型的芽孢杆菌，它能够在不利环境条件下形成内生芽孢（endospore），芽孢位于菌体中央或近端，不膨胀菌体。

在TSA或MH平板上，30°C培养24至48小时后，其菌落形态较有辨识度：菌落扁平、边缘不规则、表面粗糙呈皱褶状，这与许多常见的光滑型细菌菌落有明显区别。需注意的是，培养时间过长或温度偏高时，菌落形态可能出现变异，因此建议在规定条件下观察并记录菌落特征。该菌为严格好氧菌（aerobic），在厌氧条件下不生长。

培养条件与操作要点

根据笔者的实际操作经验，复苏和培养ATCC 6633时推荐使用MH琼脂平板，30°C培养18至24小时。如果是用于制备效价测定所需的菌悬液，一般取新鲜培养物用无菌生理盐水或0.85%氯化钠溶液洗脱，调整菌液浓度至适当浊度（通常参照McFarland标准比浊管）。

在传代培养过程中，应严格控制传代次数。一般来说，从冻干管复苏后的菌株，工作用菌种传代不宜超过5代。过多的传代可能导致菌株产芽孢能力下降或对抗生素的敏感性发生漂移，从而影响效价测定结果的准确性和重复性。每次使用前务必做菌落形态确认和纯度检查，确保无污染。

在抗生素效价测定中的应用

这是ATCC 6633最核心的应用方向。抗生素效价测定中的琼脂扩散法（agar diffusion method），也称为杯碟法（cup-plate method），其基本原理是利用抗生素在琼脂培养基中的扩散浓度梯度，抑制试验菌的生长，通过测量抑菌圈直径来定量计算抗生素的效价。ATCC 6633对多种氨基糖苷类抗生素（如新霉素neomycin、卡那霉素kanamycin）表现出良好的敏感性，且其抑菌圈边缘清晰、重复性好，因此被选为这些品种效价测定的标准试验菌。

在实际操作中，将ATCC 6633的新鲜培养物制备成均匀的菌悬液，混入或涂布于MH琼脂平板表面，待琼脂凝固后放置牛津杯（不锈钢小管）或滤纸片，加入不同浓度的抗生素标准品溶液和供试品溶液，30°C培养一定时间后测量抑菌圈直径。通过标准曲线法或二剂量法计算供试品的效价。这一方法在药典中有详细的操作规程描述，关键在于菌悬液浓度的标准化和培养条件的严格控制。

除了氨基糖苷类外，ATCC 6633在部分文献和标准中也被用于其他类别抗生素的检测方法开发。但需要强调的是，不同抗生素品种所指定的试验菌株可能不同，操作前务必查阅对应药典品种项下的具体规定，不能随意替换菌株。

在各药典及标准中的应用

ATCC 6633在多部国际药典和标准中均有明确的引用。在《美国药典》(USP)的抗生素相关通则章节中，该菌株被列为部分抗生素品种效价测定的推荐试验菌。《欧洲药典》(EP)在抗生素效价测定相关章节中同样收录了ATCC 6633的使用说明。《中国药典》2020年版在相关抗生素品种的效价测定方法中也参照了国际标准，指定使用枯草芽孢杆菌作为试验菌。

此外，在食品与药品的卫生质量检验领域，ATCC 6633也被用于培养基的质量控制验证，通过接种来确认培养基的促生长能力是否符合要求。

与ATCC 19404的区别

这一点在实际工作中极易被混淆，需要特别澄清。ATCC 19404的分类学名称为Bacillus subtilis subsp. spizizenii（枯草芽孢杆菌施皮岑亚种），其主要用途是作为生物指示剂（biological indicator）的制备菌株，用于灭菌工艺的验证，尤其是干热灭菌和环氧乙烷灭菌的效果评价。而ATCC 6633虽然同属枯草芽孢杆菌，但其亚种不同，核心用途是抗生素效价测定和药敏试验，并非用于生物指示剂的制备。

两者在芽孢耐热性、抗生素敏感性谱以及药典引用章节上均存在差异。如果将两者搞混，轻则导致检测结果不符合药典要求，重则可能影响灭菌验证的可靠性。实验室在采购和使用菌株时，务必核对ATCC编号，切勿凭"枯草芽孢杆菌"这个通用名就认为二者可以互换。

在行业质控中的典型用途

除了抗生素效价测定外，ATCC 6633在行业质控中还有其他用途。一是用于药敏试验（antimicrobial susceptibility testing）方法的验证，评估药敏纸片或检测系统的性能。二是用于培养基质量控制，通过标准接种评估培养基对革兰阳性芽孢杆菌的支持生长能力。

在分子生物学领域，ATCC 6633还因携带Bsu6633I限制性内切酶而有一定应用价值，不过这在QC/QA实验室中并不常见。

菌种保藏与传代管理

冻干菌种（lyophilized culture）应在2至8°C条件下避光保存，有效期参照供应商提供的质检报告。复苏后的工作菌种建议保存在2至8°C的斜面或平板上，短期内使用完毕。如需长期保存，可采用甘油管冷冻保藏法，于-70°C超低温冰箱中保存，保存期限一般可达一年以上。

实验室应建立菌种管理台账，记录菌种来源、复苏日期、传代次数及使用去向。对于有GMP要求的实验室，菌种管理还需纳入变更控制和偏差管理范畴，确保可追溯性。

操作安全与注意事项

ATCC 6633属于BSL-1级别微生物，对健康成人不致病，但所有涉及活菌的操作仍应在生物安全柜（BSC）中进行，操作人员应穿戴实验服、手套。芽孢杆菌属的菌株形成芽孢后对环境抵抗力较强，实验废弃物须经高压灭菌处理（121°C，至少15分钟），台面使用后应使用75%乙醇擦拭消毒。

常见问题与工程师建议

菌悬液浓度不稳定怎么办？ 多数情况下是由于培养条件不一致造成的。建议固定培养基批号（或至少使用同一厂家的产品）、培养温度和时间，并使用McFarland比浊管或浊度仪进行标准化。菌龄也是一个重要因素，过老的培养物芽孢比例高，菌悬液的活菌计数可能与比浊结果不一致。

抑菌圈边缘模糊或呈双圈现象？ 这通常与菌悬液均匀度、琼脂厚度或抗生素溶液的配制有关。检查倾注平板时琼脂厚度是否一致（一般要求4mm左右），菌悬液是否充分混匀后再倾注或涂布。双圈现象有时与供试品中含有多种抑菌成分有关，需结合品种具体情况分析。

菌株复苏后生长缓慢？ 冻干菌种复苏时，建议先在少量液体培养基中预培养数小时再转接至固体平板。如果复苏后仍然生长不良，可能是冻干管本身存在问题，建议联系供应商核实。另外，确认培养温度是否为30°C而非37°C——这是新手常犯的错误。

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杭州康氧医疗器械有限公司专注于微生物标准菌株、ATCC菌株及相关质控产品的供应与技术服务，致力于为制药企业、食品检测机构和科研院所提供可靠的微生物质控解决方案。如需了解ATCC标准菌株产品信息或技术支持，官网：www.kystrains.com

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免责声明： 本文所述菌株信息及技术参数均来源于ATCC官网、美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、《中国药典》2020年版、ISO国际标准及《消毒技术规范》等公开权威资料，仅供专业技术参考。具体实验操作请以产品随附的质检报告(COA)和说明书为准，并严格遵守所在机构的生物安全管理制度。本文不构成任何产品推荐或使用建议。

关键词标签: ATCC 6633, 枯草芽孢杆菌, Bacillus subtilis, 标准菌株, 抗生素效价测定, 药敏试验, 新霉素