ATCC 19115单增李斯特氏菌食品检测

导读： 单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是冷链食品中最危险的食源性致病菌之一，能在4°C冰箱温度下持续增殖，被称为"冰箱杀手"。作为食品微生物检测实验室的必检项目，GB 4789.30、ISO 11290-1和FDA BAM均将其列为重点监控对象。ATCC 19115作为国际公认的标准质控菌株，在方法验证、培养基质控和人员能力比对中发挥着不可替代的作用。本文从实验室实际操作角度出发，系统梳理该菌株的特性、培养要点及在各检测标准中的应用，希望能为同行提供实用参考。

菌株基本信息

| 项目 | 内容 |

|------|------|

| 菌株名称 | 单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes） |

| ATCC编号 | 19115 |

| 生物安全等级 | BSL-2 |

| 形态 | 革兰阳性短杆菌，无芽孢 |

| 最适培养温度 | 37°C |

| 生长温度范围 | 2°C ~ 45°C |

| 推荐培养基 | TSA-YE（胰酪胨大豆琼脂+0.6%酵母膏）、BHI肉汤 |

| 选择性培养基 | PALCAM琼脂、Oxford琼脂、Half-Fraser/Fraser肉汤 |

| 参考用途 | 食品微生物检验阳性对照、培养基质控、方法验证 |

| 保存方式 | 冻干粉保存或-80°C甘油管保存 |

ATCC 19115来源于人类临床标本，是李斯特菌属中最具代表性的模式菌株之一。在我们实验室日常工作中，这株菌的使用频率非常高——无论是新批次PALCAM平板的验收、新员工的操作考核，还是ISO 17025体系下的方法验证，都离不开它。

需要特别强调的是，这株菌属于BSL-2级别病原微生物，操作时必须在生物安全柜内进行，废弃物须经121°C高压灭菌处理。我见过不少新同事因为"觉得李斯特菌没那么毒"而疏忽防护，这是非常危险的习惯。

生物学特性与形态

革兰染色与形态学

单增李斯特氏菌为革兰阳性短杆菌，菌体大小约0.4~0.5 μm × 0.5~2.0 μm。在显微镜下常呈单个或短链状排列，偶尔可见V形或Y形的栅栏状排列——这个特征跟棒状杆菌有点像，初学者容易混淆。需要注意的是，培养时间过长（超过48h）或培养基偏碱性时，菌体可能出现革兰染色不稳定的情况，部分细胞会呈现革兰阴性着色。这一点我在实际染色中反复遇到过，建议对数生长期（18~24h培养物）做染色效果最好。

该菌不产芽孢、不产荚膜，在25°C培养时具有特征性的"翻滚运动"（tumbling motility），而在37°C时运动性明显减弱。伞状运动试验（umbrella motility test）是经典鉴定方法之一——在半固体培养基中，25°C穿刺培养24~48h，可以观察到表面下方约5mm处形成典型的倒伞状扩散带。

菌落形态

在TSA-YE平板上37°C培养24h，菌落呈灰白色、光滑、圆形、凸起，直径约1~2mm，边缘整齐。在45°斜射光下观察，菌落呈现特征性的蓝绿色光泽，这个观察技巧非常实用，是我们初步判定李斯特菌的重要依据。

在选择性培养基上：

• PALCAM琼脂：37°C培养24~48h，菌落呈灰绿色，周围有黑色水解圈（甘露醇不发酵，七叶苷水解产黑色产物）。菌落中央常有凹陷，这是李斯特菌的典型特征。

• Oxford琼脂：菌落较小，灰绿色，周围有黑色沉淀圈。培养48h后菌落更为明显。

• CHROMagar Listeria显色培养基：菌落呈蓝色至蓝绿色，直径约1~2mm。显色培养基的优势在于可以直接与其他李斯特菌种区分。

生化特性

| 生化试验 | 结果 |

|----------|------|

| 触酶（Catalase） | 阳性（+） |

| 氧化酶（Oxidase） | 阴性（-） |

| β-溶血 | 阳性（窄溶血环） |

| CAMP试验（金黄色葡萄球菌） | 阳性（协同溶血） |

| 七叶苷水解 | 阳性（+） |

| 甘露醇发酵 | 阴性（-） |

| 木糖发酵 | 阴性（-） |

| 鼠李糖发酵 | 阳性（+） |

| MR试验 | 阳性（+） |

| VP试验 | 阴性（-） |

| 硝酸盐还原 | 阴性（-） |

| 三糖铁（TSI） | 碱性/碱性，不产H₂S |

CAMP试验是我特别推荐的鉴定方法之一。将待测菌与金黄色葡萄球菌ATCC 25923在血平板上垂直划线，37°C培养过夜后，两线交界处出现箭头状溶血增强区域即为阳性。这个试验操作简单、结果明确，对单增李斯特氏菌的鉴定价值非常高。

嗜冷特性——"冰箱杀手"的由来

单增李斯特氏菌最引人关注的特性就是其嗜冷性。该菌可在2°C~45°C范围内生长，最适温度为37°C，但在4°C冰箱温度下仍能持续增殖，代时约为1~2天（相比之下37°C时代时仅约40分钟）。这意味着即使食品在冷藏条件下保存，如果有单增李斯特氏菌污染，菌量仍会缓慢增加。

这一特性对食品冷链检测意义深远。在我的工作经验中，送检的冷藏即食食品（如切片熟食、烟熏三文鱼、软质奶酪等）如果在保质期末期检测，李斯特菌的检出率明显高于刚生产时的样品。这也是为什么GB 4789.30和ISO 11290对即食食品中的单增李斯特氏菌实行"不得检出"的零容忍标准。

培养条件与操作要点

培养基选择

基础培养基：

实验室日常活化培养，我推荐使用TSA-YE（胰酪胨大豆琼脂+0.6%酵母膏粉）或BHI（脑心浸液）琼脂。TSA-YE是多数国际标准推荐的基础培养基，配制时需注意酵母膏粉的添加量——太少菌落长不好，太多会导致背景浑浊影响观察。

选择性增菌培养基：

• Half-Fraser肉汤（半量Fraser肉汤）：用于第一步增菌。Fraser肉汤基础中添加较低浓度的选择性抑制剂（氯化锂1.5 g/L、吖啶黄12.5 mg/L），允许受损细胞恢复。

• Fraser肉汤（全量Fraser肉汤）：用于第二步增菌。选择性抑制剂浓度加倍（氯化锂3.0 g/L、吖啶黄25 mg/L、萘啶酮酸20 mg/L），抑制杂菌的同时促进李斯特菌增殖。

选择性分离培养基：

• PALCAM琼脂：目前国标和ISO标准中使用最广泛的选择性平板。基础培养基配制后需冷却至约50°C再加入选择性添加剂（多粘菌素B、吖啶黄、头孢他啶），温度过高会破坏添加剂活性。

• Oxford琼脂：选择性较强，杂菌抑制效果好，但李斯特菌菌落偏小，需仔细观察。

培养温度与时间

| 步骤 | 温度 | 时间 | 培养基 |

|------|------|------|--------|

| 活化培养 | 37°C | 18~24h | TSA-YE或BHI琼脂 |

| 第一步增菌 | 30°C | 24h | Half-Fraser肉汤 |

| 第二步增菌 | 37°C | 24~48h | Fraser肉汤 |

| 分离培养 | 37°C | 24~48h | PALCAM/Oxford琼脂 |

| 确认培养 | 37°C | 18~24h | TSA-YE |

增菌培养温度设定30°C而非37°C，是因为第一步增菌的目的是让可能受损的李斯特菌恢复活力，同时样品中的背景杂菌在这个温度下竞争优势不那么明显。这一点很多新手不理解，经常问我"为什么不直接37°C增菌"。

实用操作经验

1. 冻干粉复溶：收到ATCC 19115冻干管后，在生物安全柜中用无菌BHI肉汤0.5mL复溶，全部转移至5mL BHI肉汤中，37°C培养24~48h。首次活化可能生长较慢，建议培养48h。

1. 工作菌种制备：活化后的培养物用BHI肉汤+15%甘油制成甘油管，-80°C保存。每管标记好日期和代次，建议工作菌种使用不超过5代。

1. 质控菌悬液制备：取18~24h新鲜培养物，用生理盐水或PBS调至0.5麦氏浊度（约10⁸ CFU/mL），再逐级稀释至所需浓度。用于培养基质控时，接种量通常为10~100 CFU/平板。

1. PALCAM平板观察：培养24h后如果没看到典型菌落，不要急着判阴性——继续培养至48h。我在实际工作中遇到过24h看不到菌落但48h后典型菌落出现的情况，特别是样品中李斯特菌初始数量较少时。

在各标准中的应用

中国国标（GB）中的应用

GB 4789.30-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》

该标准规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定性检验方法。标准采用两步增菌法：

1. 前增菌：25g样品加入225mL Half-Fraser肉汤（LB1），30°C培养24h

2. 选择性增菌：取0.1mL前增菌液转入10mL Fraser肉汤（LB2），37°C培养24~48h

3. 分离培养：分别划线接种PALCAM琼脂和Oxford琼脂（或李斯特菌显色培养基），37°C培养24~48h

4. 确认鉴定：革兰染色、触酶试验、溶血试验、生化鉴定

ATCC 19115在该标准中作为阳性对照菌株使用，用于：

• 培养基质量验证（每批次新配制培养基需接种验证）

• 检验方法的有效性确认

• 实验室人员操作能力考核

GB 4789.30-2025（新版标准）已于2025年发布实施，在方法流程上做了部分调整，但ATCC 19115作为质控菌株的地位未变。

ISO标准中的应用

ISO 11290-1:2017《食品和动物饲料微生物学——单核细胞增生李斯特氏菌和李斯特菌属检测的水平方法 第1部分：检测方法》

ISO 11290-1是全球范围内应用最广泛的李斯特菌检测标准。其核心流程同样采用两步增菌法：

1. 初级增菌：Half-Fraser肉汤，30°C，24h

2. 次级增菌：取0.1mL转入Fraser肉汤，37°C，24h（若浑浊则转接平板）或48h

3. 平板分离：Oxford琼脂（必选）+ PALCAM或CHROMagar（可选），37°C培养24h~48h

该标准对ATCC 19115的引用主要体现在培养基性能验证部分。ISO 11290-1要求每个检测实验室至少使用一株李斯特菌阳性对照菌株（推荐ATCC 19115或等效菌株）进行培养基的定期质控。

ISO 11290-2:2017则规定了计数方法，适用于需要定量检测的场景（如生产环境监控），同样使用ATCC 19115作为质控菌。

FDA BAM中的应用

FDA BAM Chapter 10: Detection of Listeria monocytogenes and Listeria species

FDA BAM第10章是食品中李斯特菌检测的重要参考方法，主要用于出口美国的食品检测。与ISO方法相比，FDA BAM方法有以下特点：

1. 增菌培养基不同：使用BLEB（Buffered Listeria Enrichment Broth）或UVM（University of Vermont Medium）系列增菌液

2. 增菌方式：25g样品加入225mL BLEB，30°C培养24h~48h

3. 分离培养基：Oxford琼脂 + PALCAM琼脂或Modified Oxford（MOX）琼脂

4. 确认方法：除生化试验外，还推荐使用API Listeria或VITEK等商业化鉴定系统

FDA BAM对质控菌株的要求更加严格，要求实验室同时使用阳性对照（ATCC 19115）和阴性对照（如粪肠球菌ATCC 29212），以验证培养基的选择性。

其他标准中的应用

• USP〈62〉非无菌产品微生物检验：虽然不是食品标准，但USP中控制菌检测部分也涉及李斯特菌的质控要求

• NMKL No.136：北欧食品分析标准，方法原理与ISO 11290类似

• SN/T 0184：中国出入境检验检疫行业标准，出口食品中李斯特菌检测

食品检测中的实际应用

高风险食品类型

基于我多年的检测经验，以下食品品类是单增李斯特氏菌的高风险载体：

1. 即食肉制品：切片火腿、午餐肉、烟熏肉制品

2. 乳制品：软质奶酪（布里奶酪、卡门贝尔奶酪）、未经巴氏消毒的牛奶

3. 水产品：烟熏三文鱼、冷藏即食海鲜

4. 即食沙拉：预切蔬菜沙拉、凉拌菜

5. 冷冻即食食品：冷冻预制菜肴（加热不充分时风险极高）

检测流程要点

样品前处理：

按照1:9（w/v）比例将25g样品加入225mL Half-Fraser肉汤中，均质器拍打2min。对于冷冻样品，建议先在2~8°C解冻后再均质，避免反复冻融影响细菌活力。

增菌培养的关键点：

• 第一步增菌（Half-Fraser, 30°C, 24h）：这一步目的是"复苏"可能在加工和冷藏过程中受损的李斯特菌，温度不宜过高

• 第二步增菌（Fraser, 37°C）：从第一步增菌液中转移0.1mL到Fraser肉汤中。注意转移量不能太大，否则会将过多杂菌带入。Fraser肉汤变黑（七叶苷水解）是李斯特菌存在的初步指示

分离鉴定要点：

• PALCAM平板划线时，建议采用四区划线法以确保获得单菌落

• 37°C培养24h后检查平板，若无典型菌落则继续培养至48h

• 挑取可疑菌落进行革兰染色、触酶试验和溶血试验

• CAMP试验可作为快速确认手段

阳性结果的判定

满足以下条件可判定为单核细胞增生李斯特氏菌阳性：

1. 革兰阳性短杆菌

2. 触酶阳性

3. 在血平板上产生窄溶血环

4. CAMP试验阳性

5. 七叶苷水解阳性

6. 鼠李糖发酵阳性，木糖发酵阴性

7. 25°C有伞状运动

菌种保藏与管理

冻干粉保存（长期）

ATCC 19115冻干管在2~8°C避光保存条件下，有效期通常为5年以上。冻干保存的核心是"不轻易开管"——一旦开管复溶，就不再是长期保存状态了。我的建议是：收到冻干管后，先核对COA（检验报告），确认菌株信息和活性指标合格，然后一次复溶，制备足够数量的工作菌种甘油管。

工作菌种管理

1. 甘油管保存：BHI肉汤培养18~24h后，与无菌甘油混合使终浓度为15~20%，-80°C保存。有效期建议不超过12个月。

2. 传代限制：从ATCC原始冻干管算起，工作菌种传代不应超过5代。这是ISO 11133培养基质控标准中的明确要求。

3. 标识管理：每管甘油管应标注菌株名称、ATCC编号、制备日期、代次编号。建议使用电子台账管理，方便追溯。

4. 定期核查：每季度从库存甘油管中取出一管，验证活性和纯度（革兰染色+生化确认），确保菌种未发生变异或污染。

短期保存

斜面培养基上4°C保存的方法，我强烈不推荐。虽然TSA-YE斜面上4°C可以存活数周，但反复传代会导致菌株活力下降、生化特性漂移，对检测结果的可靠性构成隐患。如果确实需要短期保存（比如本周要多次使用），建议制备浓菌悬液在4°C保存，使用期限不超过7天。

安全注意事项

ATCC 19115属于BSL-2级别病原微生物，在《人间传染的病原微生物名录》中属于第三类病原微生物。操作时需遵循以下安全要求：

1. 必须在BSL-2实验室的生物安全柜（BSC）内操作，严禁在开放台面上进行开管、接种、划线等操作

2. 个人防护：穿实验服、戴一次性手套、必要时佩戴护目镜。操作结束后在生物安全柜内用75%乙醇擦拭台面

3. 废弃物处理：所有接触过菌液的枪头、平板、试管等必须收集后经121°C高压灭菌至少30min

4. 意外暴露处理：若皮肤接触到菌液，立即用流动水和肥皂冲洗至少15min；若溅入眼睛，用洗眼器冲洗15min以上并就医

5. 特殊人群注意：孕妇、免疫功能低下者应避免接触该菌株。单增李斯特氏菌对孕妇和胎儿的危害尤其严重，可导致流产、死胎或新生儿脑膜炎

实验室应在显著位置张贴生物安全警示标识，并确保所有操作人员经过BSL-2操作培训和考核。

常见问题与工程师建议

Q1：PALCAM平板上24h没看到典型菌落，是否可以直接判阴性？

工程师建议：不可以。PALCAM平板上李斯特菌的典型菌落有时需要48h才能充分显现。在24h时菌落可能非常细小，灰绿色特征不明显，黑色水解圈也尚未完全形成。建议24h先观察一次并记录，然后继续培养至48h做最终判读。这也是ISO 11290-1的明确要求。

Q2：增菌过程中Fraser肉汤没有变黑，是否说明没有李斯特菌？

工程师建议：不一定。Fraser肉汤变黑是因为李斯特菌水解七叶苷产生esculetin，与培养基中的铁离子反应生成黑色沉淀。但如果样品中李斯特菌初始数量极少（如<10 CFU/25g），增菌液中菌量可能不足以在短时间内产生可见的变色反应。建议无论是否变黑，都应按规程在48h时转接平板进行分离培养。我曾经遇到过Fraser肉汤不变黑但平板上分离出阳性菌落的情况。

Q3：ATCC 19115做CAMP试验时结果不明显，怎么改善？

工程师建议：CAMP试验结果受多种因素影响。首先确认金黄色葡萄球菌ATCC 25923的活性——用新鲜的18h培养物效果最好。其次，两条划线之间保持约2mm的间距，不要交叉也不要太远。培养温度37°C，时间18~20h为宜。在自然光下用透射光观察溶血增强区域，如果结果不确定，可以用已知阳性菌株同步做对照。另外，使用新鲜配制的血平板（绵羊血，5%~7%添加量）比商品化平板效果更好。

Q4：如何判断工作菌种是否已经退化？

工程师建议：工作菌种退化的表现包括：活化时间延长（正常18~24h，退化后可能需要36~48h）、在选择性培养基上生长不良、生化反应结果不稳定（如触酶弱阳性）。我的做法是每次启用新一批甘油管时，同时做一次完整的生化鉴定面板，与原始COA数据比对。如果关键指标（如溶血性、CAMP反应）出现偏差，这批甘油管就不能再作为质控菌使用了。建议实验室保持"先进先出"的甘油管使用原则，避免库存过久。

关于杭州康氧医疗器械有限公司

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免责声明： 本文所述菌株信息及技术参数均来源于ATCC官网、美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、《中国药典》2020年版、ISO国际标准、GB国家标准及《消毒技术规范》等公开权威资料，仅供专业技术参考。具体实验操作请以产品随附的质检报告(COA)和说明书为准，并严格遵守所在机构的生物安全管理制度。本文不构成任何产品推荐或使用建议。

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