氨基酸(AA)含量检测试剂盒 新品

氨基酸(amino acid, AA)含量测定试剂盒说明书

                                               分光光度法 50管/48样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定                                             

测定意义：

肝脏、肾脏是氨基酸代谢的主要器官，故尿中氨基酸的变化最能反应肝、肾的生理状态。另外，氨基酸还能反应灼伤、伤寒等方面情况。植物体内氨基酸含量对研究植物在不同条件下及不同生长发育时期氮代谢变化、植物对氮素的吸收、运输、同化及营养状况等有重要意义。

测定原理：

氨基酸的α-氨基可与水合茚三酮反应，产生蓝紫色化合物，在570 nm有特征吸收峰；通过测定570 nm吸光度，来计算氨基酸含量。

自备仪器和用品：

台式离心机、可见分光光度计、水浴锅、1ml玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵、无水乙醇、冰和蒸馏水。

样品中AA提取：

1、按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml试剂一）进行室温匀浆，8000g，4℃离心10min，取200μl上清转移到1.5 ml EP 管中，加入200μl试剂二盖紧后（防止水分散失）置于沸水浴提取15 min；冷却至室温后待测。

2、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：试剂一体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1ml试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复30 次）；8000g，4℃离心 10min，取 200μL 上清转移到 1.5 mL EP 管中，加入 200μl试剂二盖紧后（防止水分散失）置于沸水浴 15 min，冷却至室温后待测。

3. 血清等液体：取 200μl 转移到 1.5 mL EP 管中，加入 200μl 试剂二盖紧后（防止水分散失）置于沸水浴 15 min，冷却至室温后待测。

测定步骤：

1. 分光光度计预热30 min，调节波长到570 nm，蒸馏水调零。

2. 取EP管，加入50μl待测液，500μl试剂二，500μl试剂三和50μl试剂四，混匀后盖紧瓶盖（防止水分散失），置于沸水浴中保温15 min，冷却后反复颠倒EP管数次，于570nm测定吸光值，记为A测定管。显色后务必在30min内测完。

氨基酸含量计算公式：

使用比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.0054x + 0.0737 R2 = 0.9994    x：亮氨酸标准品浓度（μg/mL）

y：吸光值 A

（1）按蛋白浓度计算

氨基酸含量（μg /mg prot）=185.2×(A 测定-0.0737)×V 样×(V样总 ÷V样)×2÷Cpr

=370.4×(A 测定-0.0737)÷Cpr

（2）按样本质量计算

氨基酸含量（μg /g 鲜重）=185.2×(A 测定-0.0737)×V 样×(V样总 ÷V样)×2÷W

=370.4×(A 测定-0.0737)÷W

（3）按细胞数量计算

氨基酸含量（μg /104 cell）=185.2×(A 测定-0.0737)×V 样×(V样总 ÷V样)×2÷细胞数量

=370.4×(A 测定-0.0737)÷细胞数量

（4）按照液体体积计算

氨基酸含量（μg /mL）=185.2×(A 测定-0.0737)×2

=370.4×(A 测定-0.0737)

W：样品质量，g；V 样：反应体系中加入样品提取液体积，0.05 ml；V 样总：样品提取液

总体积，1ml；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/ml。

注意事项：

1. 试剂盒中试剂三、试剂四均需临用前配制，且避光保存，配制好未使用完的4℃保存且3天内使用完毕。

2. 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于2.5），或者检测时吸光值下降很快，用试剂二稀释后再测定。

3. 脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应在570nm处无吸收峰，因此，570nm处测定结果不含这两种氨基酸的量。

4．最低检出限为100μmol/L。