Gibson无缝克隆试剂盒 新品

基本信息‌

‌英文名称‌：Gibson Seamless Cloning Kit
作用机制：利用DNA聚合酶、T5核酸外切酶与DNA连接酶，实现多个DNA片段的无缝克隆；T5核酸外切酶切割DNA片段末端，产生单链突出端，DNA片段通过同源序列互补配对，随后DNA聚合酶修复缺口，DNA连接酶连接形成完整的重组DNA分子。 

适用样本：多个DNA片段的无缝拼接、载体构建、基因修饰等实验，无需限制性内切酶与连接酶的传统克隆步骤。
产品概述
Gibson无缝克隆试剂盒是基于Gibson Assembly技术的分子克隆试剂盒，由Daniel G. Gibson开发，是实现多片段DNA无缝拼接的高效工具。该试剂盒包含三种关键酶：5'核酸外切酶、DNA聚合酶与DNA连接酶。5'核酸外切酶可消化DNA片段末端的5'单链区域，产生3'突出末端；DNA聚合酶可填充相邻DNA片段末端的缺口；DNA连接酶则催化连接缺口处的磷酸二酯键，最终实现多个DNA片段的无缝拼接。Gibson无缝克隆技术无需限制性内切酶切割与T4 DNA连接酶连接，仅需将带有同源末端（通常为20-40个碱基对）的多个DNA片段与Gibson酶混合物混合，在50℃条件下孵育即可完成重组。该试剂盒可同时拼接2-10个甚至更多的DNA片段，拼接效率高，适用于复杂载体构建、基因组合成、代谢途径工程等多种分子生物学研究场景，为合成生物学与基因工程研究提供了强大的技术支持。
产品特点
多片段同时拼接：一次反应可拼接2-10个DNA片段，实现复杂基因组合成与载体构建。

无缝连接技术：通过5'核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶协同作用，实现片段间无缝拼接，无冗余序列。

高效重组效率：多片段拼接效率≥80%，比传统酶切连接方法效率高10-20倍。

广泛应用场景：适用于代谢途径工程、合成生物学、基因敲除载体构建等复杂分子克隆操作。
实验前准备

试剂与耗材检查：确认PCR预混液、上下游引物、模板DNA、无酶水等试剂在有效期内，外观无浑浊、沉淀；PCR管、枪头需为无酶无菌规格。

仪器预热：提前10-15分钟启动PCR仪，设置好反应程序，确保仪器达到预设温度。

环境准备：在超净工作台内操作，佩戴无粉手套，避免交叉污染；操作前用75%酒精擦拭台面和移液器。

反应体系配制

冰上操作：将所有试剂放置于冰盒内，避免酶失活。

体系配比（以25μL体系为例）：

PCR预混液（含Taq酶、dNTP、Buffer）：12.5μL

上游引物（10μM）：1μL

下游引物（10μM）：1μL

模板DNA：1-5μL（根据模板浓度调整）

无酶水：补足至25μL

轻柔混匀：用移液器轻轻吹吸混合液3-5次，避免产生气泡；若有气泡可短暂离心去除。

分装体系：将配制好的反应液分装至PCR管中，每管25μL，盖紧管盖。

PCR仪上机反应

程序设置：根据引物Tm值和实验需求设置三步法或两步法程序：

预变性：95℃，3-5分钟

循环阶段：95℃变性30秒，55-65℃退火30秒，72℃延伸（根据片段长度调整，1kb约1分钟），循环25-35次

终延伸：72℃，5-10分钟

保温：4℃。

上机运行：将PCR管放入PCR仪样品槽，确保管盖紧密贴合；启动程序，等待反应完成。

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注意事项

无菌操作：所有试剂和耗材需高压灭菌或无菌处理，避免外源DNA污染

温度控制：酶、dNTP等试剂需-20℃储存，避免反复冻融

体系优化：根据引物Tm值、模板类型调整Mg²+浓度和退火温度

对照设置：每次实验需设置阴性对照（无模板）和阳性对照（已知阳性模板）