慢病毒荧光素酶标记试剂盒

HIV-1病毒为正链RNA病毒，基于HIV-1病毒改造来的慢病毒载体（Lentiviral vector）系统，能有效感染非分裂细胞和分裂细胞，将载体中所携带的目的基因整合到宿主细胞基因组中，使之随细胞基因组的分裂而分裂，目的基因能实现长期稳定的表达。除肿瘤细胞外，大量文献研究表明，慢病毒载体能够感染那些其它载体难以转染的细胞，如神经元细胞、淋巴细胞、心肌细胞、内皮细胞、干细胞或其它原代细胞，能介导所包含的目的基因在脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等组织或细胞中长期表达。因此，人们常用慢病毒载体将荧光素酶基因或其它目的基因导入实验动物、原代细胞或肿瘤细胞系。

本公司自行研发的专门标记干细胞的GFP/mCherry-荧光素酶双报告慢病毒载体包装试剂盒，将慢病毒载体包装过程中的难点和关键点，如载体构建和瞬时转染等步骤进行了简化和优化，并浓缩成简单的试剂盒，方便了操作，也提高了效率。高效的包装系统，优化的转染技术，最专业的技术支持，努力使您能方便地应用慢病毒载体技术为活体成像的应用提供支撑。

这一系统的目的，主要是为了解决以下问题：
● 用GFP/mCherry-荧光素酶基因双报告慢病毒系统稳定感染各种细胞，能大大提高荧光蛋白和荧光素酶基因的表达效率。

●提供方便的双标记系统，扩大了活体成像技术在干细胞和肿瘤等方面的研究和应用。

优势：

• 高效的感染：包装的病毒系统可侵染最多的细胞类型，包括非分化细胞和难以转染细胞（原代、血、干细胞）。
• 表达稳定，可遗传：包装基因整合到基因组DNA上，高水平表达，低变异。
• 不干扰细胞：细胞功能不受侵染过程影响。
• 生物安全：三质粒系统包装的安全性；非人源HIV 病毒限度降低风险。
• 高包装效率：病毒包装时采用的转染试剂提供系统质粒转染效率接近100%。
• 完整的病毒包装体系：提供载体构建、转染、病毒浓缩和纯化、滴度检测等病毒包装产品。程度的降低包装繁琐程度，提供包装病毒产品。此外，本系统同时表达荧光蛋白和荧光素酶双报告基因，即可通过荧光显微镜直接观察感染效率，也可通过流式细胞术直接分选感染细胞，可方便的通过活体成像仪跟踪细胞在体内的生长情况，为干细胞和肿瘤等研究提供了便捷的体外观察和活体成像工具。

本公司荧光素酶慢病毒载体包装试剂盒由二部分组成：

  1. 慢病毒上清液400μl，病毒滴度6×10⁷

  2. 转染试剂Polybrene（1000×，10ul）

筛选标记：Hygromycin

实验过程：

慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。本试剂盒包括了所有的转录并包装目的基因到重组的慢病毒载体所需要的所有辅助蛋白。您可以将慢病毒上清液直接用于干细胞的感染，荧光素酶基因进入到干细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达荧光素酶等效应分子。

常见问题解答:

1.     我们用的包装系统效率远高于Invitrogen的系统，具体图谱没有电子版本，基本结构差不多，但比Invitrogen的多了cPPT和WPRE，因此包装效率高了很多。

2.     质粒混合物有三种载体组成，其中包括一个荧光素酶表达载体，另两个是慢病毒包装载体，三种载体共转染293T细胞后，在细胞中重组为慢病毒，并分泌至培养上清中，一般滴度在5×10⁶左右。病毒可以浓缩，我们可提供专用的病毒浓缩液，但要想达到10¹⁰的话，则需要包装100盘250px左右的细胞然后浓缩，工作量和花费都很巨大。

3.     转染效率，对于人类肿瘤细胞来说是90%左右，整合到基因组里稳定表达的几率是10%左右；对于一般方法很难转染的鼠源性的肿瘤细胞的转染效率是50%左右。

4.     100μl病毒上清液的病毒滴度是5×10⁶—1×10⁷之间。

5.     50μl的病毒上清液可用12孔板转染，12孔板每孔感染时细胞量为2×10⁵，每孔需要加入的病毒上清液是20-50μl（需根据具体细胞调整），100μl最多可感染5个孔。病毒感染时尽量采用较少的培养基，如12孔每孔加500μl即可；Polybrene按1:1000加入，感染12小时后换液常规培养。

6.     包装好的病毒上清液在3天之内转染细胞，建议不反复冻存。否则在一冻一溶的过程中，病毒滴度会降低一半，病毒活性也会降低。

7.     在转染细胞前，换用无血清培养基，加入转染试剂Polybrene（1000×,1ml培养基加0.5ul）,摇匀，转染6-8小时换有血清培养基。

8.  细胞的筛选：转染后的48-72小时加入筛选药物Hygromycin（100ug/ul）,每毫升培养基加3-5ul, 24h换液。细胞对潮霉素的反应比较敏感，一般处理24小时后撤药，细胞状态恢复后再做同样处理，根据需要处理2-3次即可，切不可持续给药！否则细胞会全部死亡。潮霉素一般用潮霉素B，没有厂家区别，质量一般都有保证。以后细胞逐渐由24孔板传至12孔板、6孔板、150px盘、250px盘中培养。

9.  细胞的鉴定：取5×10⁴细胞铺入24孔板，用Passive Lysis裂解液裂解，加入荧光素酶作用底物，将转染质粒的细胞与阴性，阳性对照共同进行单报告基因检测。

10.转染干细胞的MOI值建议梯度为50倍、75倍、100倍。按照MOI值100计算的话，2×10⁷病毒量可转染的细胞数是20万个细胞。使用24孔板，每孔1万个细胞的话，可以转20个孔。

11.  本试剂盒具有很高的转染效率，在95%以上。对于干细胞，可以选择不加Hygromycin筛选，通过荧光蛋白进行流式检测和分选。在实验过程中发现，很难掌握合适的Hygromycin筛选压力，造成实验的麻烦。如果因实验需要，必须加Hygromycin筛选，建议先用未标记的干细胞进行耐受剂量的摸索，切勿直接用标记过的干细胞进行剂量摸索，免得损失标记过的干细胞。

12.  绝大多数细胞感染慢病毒后生长特性不变，也有少数细胞经病毒转染后增殖变慢，可考虑重新感染建系。