无乳链球菌染料法荧光定量PCR试剂盒

检测原理

基于SYBR Green荧光染料法，通过特异性引物靶向GBS基因高度保守区域，实时监测扩增荧光信号，实现核酸的定性与定量分析。

试剂盒组成

预混液：含DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液及SYBR Green染料（即开即用）。

引物混合液：针对GBS优化的特异性引物对。

阳性对照：GBS DNA片段（已知拷贝数，需按梯度稀释使用）。

阴性对照：无核酸酶水。

模板稀释液：用于标准品或样本的梯度稀释。

操作步骤

1. 样本前处理

临床样本（如阴道分泌物、尿液、血液）：需提取DNA，建议使用商业化核酸提取试剂盒。

质量控制：提取后DNA建议测定浓度及纯度（A260/A280比值1.8-2.0）。

2. 反应体系配制（20μL体系）

| 组分 | 体积（μL） |

| 预混液 | 10 |

| 引物混合液 | 2 |

| 模板DNA | 2 |

| 无核酸酶水 | 6 |

3. PCR扩增程序

预变性：95℃ 5分钟；

循环阶段（40 cycles）：95℃ 15秒 → 60℃ 30秒（采集荧光信号）；

熔解曲线分析：60℃至95℃，每0.5℃递增，持续5秒。

结果判读

阳性：Ct值≤35，且熔解曲线呈现单一峰值；

阴性：无Ct值或Ct值>35，熔解曲线无特异峰；

注意事项：需同时满足阴性对照无信号、阳性对照Ct值在预期范围内。

性能参数

灵敏度：最低检测限为10拷贝/μL；

特异性：不与A组链球菌、金黄色葡萄球菌等常见病原体交叉反应；

线性范围：10^1-10^7拷贝/μL（R²≥0.99）。

储存与运输

储存条件：-20℃避光保存，避免反复冻融（有效期12个月）；

运输条件：冰袋或干冰运输。

注意事项

实验分区操作，避免气溶胶污染；

建议设置3次技术重复及阴性/阳性对照；

熔解曲线分析需排除引物二聚体干扰。

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