马链球菌马亚种染料法荧光定量PCR试剂盒

产品用途

本试剂盒基于 SYBR Green I 染料法荧光定量PCR技术，专用于快速、高灵敏度检测马源样本（如鼻拭子、咽拭子、脓肿液、组织等）中的 马链球菌马亚种 (S. equi subsp. equi) DNA。适用于：

马传染性淋巴管炎（Strangles）的临床诊断

马场病原体监测与净化

治疗效果评估

流行病学调查

检测原理

核酸提取：样本中提取基因组DNA。

qPCR扩增：

使用 马链球菌马亚种特异性引物 靶向保守基因（如 SeM 基因或 16S rRNA）。

SYBR Green I 染料嵌入双链DNA，荧光信号随产物扩增增强。

实时监测：通过qPCR仪检测荧光强度，生成扩增曲线和熔解曲线。

结果判读：

Ct值 ≤ 35 且熔解曲线呈单一峰 → 阳性

Ct值 > 35 或无Ct值 + 熔解曲线异常 → 阴性

试剂盒组成

(100次反应)

| 组分 | 体积/数量 | 储存条件 |

| qPCR预混液 (2×) | 1.25 mL × 2管 | -20℃避光 |

| 马链球菌马亚种引物混合液 | 150 μL × 1管 | -20℃避光 |

| 阳性对照 (S. equi DNA) | 50 μL × 1管 | -20℃ |

| 阴性对照 (无核酸水) | 1 mL × 1管 | -20℃ |

| RNase-Free水 | 1 mL × 1管 | 室温/4℃ |

技术参数

检测靶标：SeM 基因（或其他保守基因）

灵敏度：≤ 10 拷贝/反应

特异性：

可检出 S. equi subsp. equi

不交叉反应：马链球菌兽疫亚种 (S. equi subsp. zooepidemicus)、其他链球菌属、马常见病原菌。

线性范围：10² ~ 10⁹ 拷贝/μL（R² ≥ 0.99）

重复性：批内/批间 CV < 5%

操作步骤

1. 样本前处理

鼻/咽拭子：置于无菌PBS或DNA保存液中震荡，离心取上清。

组织/脓肿液：研磨后离心取上清。

推荐使用商业核酸提取试剂盒（如柱式法）提取DNA。

2. qPCR反应体系配制 (20 μL/反应)

| 组分 | 体积 |

| 2× qPCR预混液 | 10 μL |

| 引物混合液 | 1.0 μL |

| DNA模板 | 2~5 μL |

| RNase-Free水 | 补足至20 μL |

3. qPCR程序设置 (以ABI 7500为例)

| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | 信号采集 |

| 预变性 | 95℃ | 5 min | 1 | 关闭 |

| 扩增 | 95℃ | 15 sec | 40 | 关闭 |

| | 60℃ | 45 sec | | 开启 |

| 熔解曲线 | 95℃→60℃→95℃ | 按仪器默认程序 | 1 | 开启 |

结果判读

阳性对照：Ct ≤ 30，熔解曲线峰值Tm = (XX ± 1)℃。

阴性对照：无Ct值，无熔解峰。

待测样本：

阳性：Ct ≤ 35 + Tm与阳性对照一致。

可疑：35 < Ct ≤ 38 → 建议复测或确认。

阴性：无Ct值或Ct > 38。

注：熔解曲线单一峰可排除引物二聚体干扰。

注意事项

实验室分区：严格分隔试剂配制区、样本处理区、扩增区。

污染防控：

使用无核酸酶耗材，穿防护服，更换手套。

阳性对照最后加样。

样本质量：OD260/280介于1.8~2.0，避免溶血或抑制剂干扰。

储存条件：

未开封试剂：-20℃避光保存（有效期12个月）。

解冻后预混液：4℃保存≤1周，避免反复冻融。

质量控制

每批次检测需包含：

阳性对照 → 验证检测有效性

阴性对照 → 监控污染

无模板对照 (NTC) → 排除试剂污染

若对照异常，实验无效需重做。

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