棒杆菌通用染料法荧光定量PCR试剂盒

棒杆菌通用染料法荧光定量PCR试剂盒

商品属性

产品概述

本试剂盒采用SYBR Green I 荧光染料法，通过特异性引物扩增棒杆菌属（Corynebacterium）保守基因区域（如16S rRNA或rpoB基因），实现对样本中棒杆菌的快速、高灵敏度定量检测。适用于临床病原体筛查、食品安全检测、环境微生物监测等领域。

检测原理

染料结合：SYBR Green I 嵌入双链DNA后发射荧光信号，强度与PCR产物量成正比。

实时监测：每轮PCR循环采集荧光值，生成扩增曲线，通过Ct值（阈值循环数）定量初始模板浓度。

熔解曲线分析：扩增结束后升温解链，验证产物特异性（单一峰形为特异性扩增）。

试剂盒组成

| 组分 | 体积/数量 | 保存条件 |

| 2× SYBR Green qPCR Master Mix | 1 mL × 1管 | -20℃避光 |

| 棒杆菌通用引物混合液（F+R） | 100 μL × 1管 | -20℃ |

| 阳性对照（C. diphtheriae DNA） | 50 μL × 1管 | -20℃ |

| 阴性对照（无核酸水） | 1 mL × 1管 | -20℃ |

| RNase-Free ddH₂O | 1 mL × 1管 | 室温 |

技术参数

检测靶标：棒杆菌属通用保守基因（提供引物序列号：Cory-Uni-F/R，需保密可询）

灵敏度：≥10 copies/μL

线性范围：10² ~ 10⁸ copies/μL（R² > 0.99）

特异性：不交叉反应于葡萄球菌、链球菌等常见革兰氏阳性菌

重复性：CV < 5%（批内/批间）

操作流程

1. 样本制备

提取待测样本（痰液、血液、食品匀浆等）DNA，推荐使用柱式基因组DNA提取试剂盒。

2. PCR反应体系配制（20 μL体系）

| 组分 | 体积 |

| 2× SYBR Green Master Mix | 10 μL |

| 棒杆菌引物混合液 | 1 μL |

| DNA模板 | 2 μL |

| ddH₂O | 7 μL |

注：每样本设3复孔，阳性/阴性对照同步运行。

3. qPCR程序设置

| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | 采集模式 |

| 预变性 | 95℃ | 5 min | 1 | - |

| 扩增 | 95℃ | 15 sec | 40 | SYBR通道 |

| 退火/延伸 | 60℃ | 30 sec | | |

| 熔解曲线 | 65℃ → 95℃ | 每0.5℃升/5 sec | 1 | 连续采集 |

数据分析

阈值设定：取指数扩增期荧光信号上升拐点（建议仪器自动计算）。

定量方法：

绝对定量：使用标准品（需另购）绘制标准曲线（Ct值 vs log拷贝数）。

相对定量：以内参基因（如GAPDH）校正样本间差异。

特异性验证：熔解曲线单一峰（Tm值：85±1℃），杂峰提示引物二聚体或非特异扩增。

注意事项

避免污染：分区操作（试剂准备区→样本处理区→扩增区），使用带滤芯枪头。

试剂稳定性：解冻后Master Mix需涡旋混匀，避免反复冻融（≤3次）。

引物特异性：新样本类型建议测序验证扩增产物。

生物安全：阳性对照含灭活DNA，仍须按Ⅱ类病原体处理废弃物。

预期用途

本产品仅限科研使用，不适用于临床诊断。可检测包括：

致病性棒杆菌：C. diphtheriae（白喉杆菌）、C. ulcerans

条件致病菌：C. jeikeium、C. striatum

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