羟脯氨酸（HYP）测试盒

商品属性

测定意义与原理

测定意义

羟脯氨酸（HYP）是机体胶原蛋白主要成分之一，占胶原蛋白的13.4%，在其他蛋白质中含量极低，因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。其测定具有重要的临床和科研价值：临床诊断：诊断和监测肝硬化、肺纤维化、肾纤维化等疾病疾病监测：评估手术创伤、烧伤等疾病的组织修复情况生物学研究：了解胶原蛋白代谢和细胞外基质重塑农业研究：研究植物细胞壁结构和抗逆机制食品检测：评估胶原蛋白保健品的质量和纯度

测定原理

样品经酸水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。通过测定560nm吸光值，可计算HYP含量。反应式如下： 胶原蛋白→酸水解游离HYP胶原蛋白酸水解游离HYP 游离HYP+氯胺T→氧化HYP氧化产物游离HYP+氯胺T氧化HYP氧化产物 HYP氧化产物+对二甲氨基苯甲醛→酸性条件红色化合物HYP氧化产物+对二甲氨基苯甲醛酸性条件红色化合物

试剂盒组成

可见分光光度法试剂盒

组分 规格 作用说明

提取液 液体60mL×1瓶 含6mol/L盐酸溶液，用于水解组织样本产生游离HYP

试剂一 液体6mL×1瓶 含氯胺T溶液，氧化剂

试剂二 液体6mL×1瓶 含对二甲氨基苯甲醛溶液，显色剂

试剂三 液体25mL×1瓶 含缓冲液，调节反应pH值至酸性条件

标准品 液体1mL×1支 含羟脯氨酸标准品，用于建立标准曲线

ELISA法试剂盒

组分 规格 作用说明

包被板 96孔×1块 预包被抗HYP抗体

酶标抗体 液体6mL×1瓶 含HRP标记抗HYP抗体

标准品 液体1mL×6管 含0、1、2、4、8、16μmol/L HYP标准品

样本稀释液 液体20mL×1瓶 含PBS缓冲液（pH7.4），用于稀释样本

洗涤液 液体20mL×1瓶 含0.05% Tween-20的PBS缓冲液，用于洗板

底物液 液体10mL×1瓶 含TMB底物液，用于显色反应

终止液 液体10mL×1瓶 含2mol/L H₂SO₄溶液，用于终止显色反应

自备仪器与试剂

必备仪器

可见分光光度法：可见光分光光度计（560nm检测通道）、1mL玻璃比色皿

微量法：酶标仪（560nm检测通道）、微量石英比色皿/96孔板

HPLC法：高效液相色谱仪、紫外检测器/荧光检测器、C18色谱柱

通用：低温离心机（≥10000g）、恒温水浴锅、可调式移液器、电子天平、烘箱/高压消毒器

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、玻璃管/EP管、研钵/组织匀浆器

自备试剂：蒸馏水/去离子水、6mol/L盐酸、无水乙醇、异丙醇、10mol/L NaOH溶液

样本前处理方法

动植物组织样本取样：称取约0.2-0.5g组织，用蒸馏水洗净，滤纸吸干，剪碎水解：加入2-5mL提取液，置于110℃烘箱水解6至12小时；或高压消毒器中15磅保持30min中和：冷却后用10mol/L NaOH溶液调节pH值至6-8范围内定容：用蒸馏水定容至2-5mL，取上清液，12000-16000g 25℃离心20min，取上清待测

细胞样本收集：取500万个细胞，加入1-2mL细胞提取液水解：高压消毒器中15磅保持30min，自然降压后待测；或110℃烘箱水解6小时中和：冷却后用10mol/L NaOH溶液调节pH值至6-8范围内定容：用蒸馏水定容至2mL，取上清液，16000g 25℃离心20min，取上清待测

血清/尿液样本血清：取0.1mL血清，加入0.5mL无水乙醇使蛋白质沉淀，8000g 4℃离心5min，取上清，氮吹或沸水浴挥发干乙醇，冷却后加入0.2mL 50%异丙醇溶解待测尿液：取1mL尿液，加入0.5mL无水乙醇使蛋白质沉淀，8000g 4℃离心5min，取上清，直接测定或稀释后测定

测定操作步骤

可见分光光度法操作仪器预热：分光光度计预热30min以上，调节波长至560nm，蒸馏水调零标准曲线绘制：

将标准品稀释成0、30、15、7.5、3.75、1.875μg/mL系列浓度

取100μL标准溶液于比色管中，加入100μL试剂一和100μL试剂二，混匀

室温静置20min，加入100μL试剂三，混匀

60℃水浴20min，取出冷却至室温，用蒸馏水定容至5mL

以蒸馏水为参比，测定560nm波长下的吸光度，绘制标准曲线

标准曲线方程：y=64.875x+0.0251，R²=0.9991（x为标准品浓度）样品测定：

取100μL样品溶液，按标准曲线步骤操作，测定吸光度

根据标准曲线计算样品中HYP含量

ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL

样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度

结果计算方法

单位定义

μg/g 鲜重：每克鲜重样本中羟脯氨酸的含量

μg/mg 蛋白：每毫克组织蛋白中羟脯氨酸的含量

μmol/L：每升样本中羟脯氨酸的浓度

可见分光光度法计算公式

HYP含量(μg/g鲜重)=(A测定−A空白)−0.025164.875×V总WHYP含量(μg/g鲜重)=64.875(A测定−A空白)−0.0251×WV总

A测定：样本管吸光度值

A空白：空白管吸光度值

V总：样本提取液总体积（mL）

W：样本质量（g）

ELISA法计算公式

HYP浓度(μmol/L)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数HYP浓度(μmol/L)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数

性能指标

指标 可见分光光度法 ELISA法 HPLC法

线性范围 0~30μg/mL 0~160μg/mL 0~1000μmol/L

最低检测限 ≤0.1μg/mL ≤0.1μg/mL ≤0.01μmol/L

回收率 90%~110% 90%~110% 94%~102%

批内精密度 CV≤2.1% CV≤10% CV≤2.0%

批间精密度 CV≤5.0% CV≤15% CV≤3.0%

稳定性 2-8℃保存12个月 2-8℃保存6个月 2-8℃保存12个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免HYP分解；-20℃可保存3个月

植物组织需迅速处理，避免细胞壁降解

液体样本需避免溶血和细菌污染

若OD值大于0.8-1.0，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数

试剂使用：

羟胺T溶液需避光保存，避免分解失效

ELISA法试剂需避免反复冻融，用后立即放回2-8℃保存

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

分光光度法反应需严格控制加热时间，确保水解完全

ELISA法需严格控制温育时间和温度，避免影响显色反应

试剂有一定的毒性，请操作时做好防护措施，防止吸入或与皮肤接触

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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