海藻糖6磷酸合成酶(TPS)测试盒
测定意义与原理
测定意义
海藻糖是由两个葡萄糖分子以α,α-1-1糖苷键连接而成的一种非还原双糖，广泛存在于酵母菌、霉菌、食用菌、低等植物、昆虫、无脊椎动物和高等植物等多种有机体中。海藻糖的非还原性决定了它对酸、碱、高温等的稳定性，另外，它本身具有很强的吸水性，使它在生物体内具有抗脱水作用，在逆境条件下可通过识别外界刺激、产生和传递信号、基因表达和代谢调节来保护植物免受环境的伤害。植物体内主要以葡萄糖为底物合成海藻糖，该反应首先在海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphatesynthase, TPS)的作用下，催化尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和6-磷酸葡萄糖反应生成中间产物6-磷酸海藻糖，再在海藻糖-6-磷酸磷酸酶(trehalose6-phosphatephosphatase, TPP)的作用下去磷酸化，生成海藻糖。因此，测定TPS活性对于研究植物逆境具有重要意义。
测定原理
TPS催化UDPG与G6P生成海藻糖-6-磷酸，同时产生UDP；UDP在丙酮酸激酶与乳酸脱氢酶作用下，氧化NADH为NAD+，NADH的下降速率与UDP含量成正比，通过340nm吸光度下降速率反映TPS活性。
试剂盒组成
分光光度法试剂盒
组分 规格 作用说明
试剂一 粉剂×1瓶,-20℃保存 含底物尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)，酶促反应底物
试剂二 粉剂×2瓶,-20℃保存 含丙酮酸激酶与乳酸脱氢酶混合液，催化NADH氧化
试剂三 粉剂×1瓶,-20℃避光保存 含6-磷酸葡萄糖(G6P)，酶促反应底物
试剂四 100μL×1瓶,4℃避光保存 含NADH溶液，反应辅酶
试剂五 液体100mL×1瓶,4℃保存 含反应缓冲液，维持反应体系pH稳定
标准品 粉剂×1支,-20℃保存 含UDP标准品，临用前用试剂五溶解
ELISA法试剂盒
组分 规格 作用说明
包被板 96孔/48孔 预包被TPS单抗
标准品 1mL×1支 含TPS标准液，浓度系列为0、20、40、80、160、320ng/mL
酶标二抗 12mL/6mL×1瓶 辣根过氧化物酶标记的TPS多抗
底物溶液 12mL/6mL×1瓶 TMB显色液
终止液 12mL/6mL×1瓶 2M H2SO4，终止显色反应
洗涤液 20×25mL/20×15mL×1瓶 含Tween-20的PBS缓冲液
封闭液 1×20mL/1×10mL×1瓶 含BSA的PBS缓冲液，用于封闭非特异性结合
自备仪器与试剂
必备仪器
分光光度法：分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水
ELISA法：酶标仪（450nm波长）、精密移液器、恒温水浴箱、洗板机（可选）
必备耗材
离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器、超声破碎仪
自备试剂：蒸馏水/去离子水
样本前处理方法
动植物组织样本取样：按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),冰浴中匀浆。离心：8000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
微生物、细胞样本收集：先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3S,间隔10S,重复30次);离心：8000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
血清、血浆样本处理：直接检测
测定操作步骤
分光光度法操作仪器预热：分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零;调节水浴锅至30℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)。试剂配制：
临用前将试剂一加入10mL试剂五溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
临用前每瓶试剂二加入25mL试剂五溶解；现配现用；
临用前试剂三加入0.1mL试剂五溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
临用前，先配置好1瓶试剂二和试剂三，然后在试剂二瓶中加入25μL试剂三和25μL试剂四，充分混匀，现配现用。样本测定：
试剂名称(μL) 空白管 测定管 标准管
蒸馏水/样本/标准品 100 100 100
试剂一 500 500 500
工作液 200 200 200
试剂五 100 100 100
混匀,30℃反应20min,95℃水浴2min灭活,冷却至室温,10000g4℃离心5min,取上层反应液待测
在1mL玻璃比色皿中加入上述反应液,测定340nm下5min后吸光值A1与10min后吸光值A2,ΔA=A1-A2
ELISA法操作试剂准备：将洗涤液用蒸馏水稀释20倍,其他试剂平衡至室温加样：分别设置空白孔、标准孔、样本孔,加入相应溶液孵育：37℃孵育120min,弃去液体,甩干,不用洗涤加检测溶液A：每孔加检测溶液A工作液100μl(在使用一小时内配制),37℃反应60min洗板：弃去孔内液体,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分钟,大约400μl/每孔,甩干加检测溶液B：每孔加检测溶液B工作液100μl,37℃反应60min洗板：弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分钟,350μl/每孔,甩干显色：每孔加底物溶液90μl,37℃避光显色(30分钟内,肉眼可见标准品的3-4孔有明显的梯度兰色,后3-4孔梯度不明显,即可终止)终止：每孔加终止溶液50μl,终止反应,此时蓝色立转黄色测定：用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)
结果计算方法
单位定义
U/g FW：每克鲜重样本中每分钟消耗1nmol NADH的酶活力单位
U/mg prot：每毫克蛋白质中每分钟消耗1nmol NADH的酶活力单位
U/mL：每毫升样本中每分钟消耗1nmol NADH的酶活力单位
计算公式
TPS活性(U/g FW)=ΔA×V总×nε×d×W×V样×TTPS活性(U/g FW)=ε×d×W×V样×TΔA×V总×n TPS活性(U/mg prot)=ΔA×V总×nε×d×Cpr×V样×TTPS活性(U/mg prot)=ε×d×Cpr×V样×TΔA×V总×n
ΔA：吸光度变化值（A1-A2）
ε：NADH的摩尔消光系数（6.22×10³ L/mol/cm）
d：比色皿光径（cm）
V总：样本提取液总体积（mL）
V样：测定时加入样本体积（mL）
n：样本稀释倍数
W：样本鲜重（g）
Cpr：样本蛋白质浓度（mg/mL）
T：反应时间（min）
性能指标
指标 分光光度法 ELISA法
线性范围 0~100U/mL 20~320ng/mL
最低检测限 ≤1U/mL ≤5ng/mL
回收率 90%~110% 95%~105%
批内精密度 CV≤2.0% CV≤3.0%
批间精密度 CV≤5.0% CV≤6.0%
稳定性 4℃保存6-12个月 4℃保存6-12个月
注意事项
样本处理：
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
样本需新鲜制备,避免TPS失活；-20℃可保存3个月
组织样本需冰浴匀浆,避免酶失活
超声波破碎时需控制功率和时间,避免样本降解
试剂使用：
工作液需临用前配制,避免氧化失效
不同批号试剂不能混用,需重新绘制标准曲线
标准品需4℃保存,避免反复冻融
NADH溶液需避光保存,避免氧化
测定过程：
反应时间需严格控制,确保实验结果的一致性
显色后需立即测定,避免NADH进一步氧化
若吸光度值超出线性范围,需稀释样本后重新测定
质量控制：
每次实验需设置空白对照和标准品对照,验证实验体系稳定性
定期校准仪器,确保波长和吸光度准确性
每次实验请使用新的标准品溶液
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