鸟氨酸转氨酶（OAT）测试盒

商品属性

测定意义与原理

测定意义

鸟氨酸转氨酶（δ-OAT）是植物以鸟氨酸为前体合成脯氨酸途径的关键酶，对植物适应逆境胁迫起关键作用，其测定具有重要的生理和科研价值：植物生理研究：探究植物抗逆机制，如抗旱、抗盐、抗寒等农业应用：筛选抗逆性强的作物品种，提高作物产量环境监测：评估土壤和水体污染对植物生理的影响生物学研究：了解氨基酸代谢途径和植物生长发育机制

测定原理

分光光度法/微量法

鸟氨酸和α-酮戊二酸在OAT和NADH作用下发生氨基转移反应生成吡咯啉-5-羧酸（P5C），同时产生NAD+，通过检测340nm处吸光度的变化可反映出OAT活性的高低。反应式如下： 鸟氨酸+α-酮戊二酸+NADH→OAT吡咯啉-5-羧酸(P5C)+NAD+鸟氨酸+α-酮戊二酸+NADHOAT吡咯啉-5-羧酸(P5C)+NAD+

ELISA法

采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验：预先包被植物鸟氨酸转氨酶（OAT）捕获抗体的包被微孔中加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体经过温育并彻底洗涤，用底物TMB显色TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色颜色深浅与样品中的植物鸟氨酸转氨酶（OAT）呈正相关，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)计算样品浓度

试剂盒组成

分光光度法/微量法试剂盒

组分 规格 作用说明

提取液 液体100mL×1瓶 含Tris-HCl缓冲液（pH8.0），用于提取样本中的OAT

试剂一 液体6mL×1瓶 含鸟氨酸溶液，OAT反应底物

试剂二 液体6mL×1瓶 含α-酮戊二酸溶液，OAT反应共底物

试剂三 液体6mL×1瓶 含NADH溶液，辅酶，用于检测OAT活性

试剂四 液体6mL×1瓶 含缓冲液，调节反应pH值

试剂五 液体6mL×1瓶 含标准品（OAT），用于建立标准曲线

ELISA法试剂盒

组分 规格 作用说明

包被板 96孔×1块 预先包被植物鸟氨酸转氨酶（OAT）捕获抗体

酶标试剂 液体6mL×1瓶 含HRP标记的检测抗体，用于检测植物鸟氨酸转氨酶（OAT）

标准品 0.3mL×6管 含植物鸟氨酸转氨酶（OAT）标准品（0、2、4、8、16、32、64U/L）

样本稀释液 10mL×1瓶 用于稀释样本和标准品

显色剂A液 6mL×1瓶 含过氧化氢溶液

显色剂B液 6mL×1瓶 含TMB溶液

终止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液

20倍浓缩洗涤液 20mL×1瓶 用于洗涤酶标板

自备仪器与试剂

必备仪器

分光光度法/微量法：紫外分光光度计/酶标仪（340nm检测通道）、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水

ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板、37℃恒温箱、洗板机

通用：低温离心机（≥10000g）、恒温水浴锅、可调式移液器、电子天平

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、三氯乙酸

样本前处理方法

植物样品取样：称取约0.1g组织，用蒸馏水洗净表面杂质，用滤纸吸干匀浆：按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例，进行冰浴匀浆离心：10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测稀释：若OAT活性过高，用提取液稀释1-10倍后测定

血清/血浆样本采集：空腹采集静脉血，分离血清/血浆保存：4℃可保存3天，-20℃可保存1个月检测：直接检测或稀释后测定

细胞样本收集：收集1×10⁶细胞，加入1mL提取液破碎：冰浴超声波破碎（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

液体样本（尿液/脑脊液/发酵液）尿液：离心去除沉淀，取上清液测定；或用样本稀释液稀释10-20倍脑脊液：无菌采集，离心去除沉淀，取上清液测定发酵液：过滤去除菌体，取滤液测定；或用样本稀释液稀释10-100倍

测定操作步骤

分光光度法/微量法操作仪器预热：分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零试剂配制：临用将试剂五转移到试剂四中混合溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融样本测定：

工作液于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min

在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、200μL工作液和15μL试剂六，混匀，记录340nm处初始吸光值A₁和2min后的吸光值A₂，计算ΔA=A₁-A₂

空白对照：以蒸馏水代替样本，同样处理标准曲线绘制：将标准品稀释成0、20、40、60、80、100U/L系列浓度，同样处理

ELISA法操作试剂准备：

将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用

标准品按说明书稀释成0、2、4、8、16、32、64U/L系列浓度加样：

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加温育：

除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔

37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：

弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：

每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：

每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值

结果计算方法

单位定义

U/L：每升样本每分钟消耗1nmol NADH的酶量

U/g 鲜重：每克鲜重样本每分钟消耗1nmol NADH的酶量

U/mgprot：每毫克组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH的酶量

分光光度法/微量法计算公式

OAT活性(U/L)=ΔA×V反总÷(ε×d)×109V样×Cpr÷TOAT活性(U/L)=V样×CprΔA×V反总÷(ε×d)×109÷T

ΔA：340nm处吸光度变化值（A₁-A₂）

V反总：反应体系总体积（L）

ε：NADH摩尔消光系数（6.22×10³ L/mol/cm）

d：比色皿光径（cm）

V样：样本体积（L）

Cpr：蛋白浓度（mg/mL）

T：反应时间（min）

ELISA法计算公式

OAT含量(ng/mL)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数OAT含量(ng/mL)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数

性能指标

指标 分光光度法/微量法 ELISA法

线性范围 0~100U/L 2U/L–64U/L

最低检测限 ≤0.1U/L ≤0.1U/L

回收率 90%~110% 90%~110%

批内精密度 CV≤5.0% CV≤10%

批间精密度 CV≤8.0% CV≤15%

稳定性 2-8℃保存12个月 2-8℃保存6个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免OAT失活；-20℃可保存3个月

植物组织需迅速处理，避免酶失活

液体样本需避免溶血和细菌污染

试剂使用：

NADH溶液需-20℃避光保存，避免分解失效

ELISA法试剂需避免反复冻融，用后立即放回2-8℃保存

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

分光光度法反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）

ELISA法需严格控制温育时间和温度，避免影响显色反应

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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