天冬酰胺合成酶（AS)测试盒 新品

商品属性

测定意义与原理

测定意义

天冬酰胺合成酶（AS）是生物体内广泛存在的关键氨基转移酶，其测定具有重要的生理和科研价值：生理研究：参与氨解毒代谢和氨基酸合成途径，揭示植物抗逆机制疾病诊断：与肿瘤细胞增殖密切相关，可作为肿瘤标志物农业应用：评估植物氮素利用效率，指导合理施肥环境科学：监测土壤和水体中微生物活性，评估生态系统功能生物制药：用于酶制剂质量控制和发酵过程优化

测定原理

比色法（奈氏试剂法）

L-天冬酰胺+H2O→AS酶L-天冬氨酸+NH3L-天冬酰胺+H2OAS酶L-天冬氨酸+NH3 NH3+奈氏试剂→棕黄色络合物NH3+奈氏试剂→棕黄色络合物 在600nm波长下测定吸光度，其吸光度变化速率与AS酶活性成正比。

ELISA法

采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验：预先包被天冬酰胺合成酶（AS）抗体的包被微孔中加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体经过温育并彻底洗涤，用底物TMB显色TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色颜色深浅与样品中的天冬酰胺合成酶（AS）含量呈正相关，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)计算样品浓度

试剂盒组成

比色法试剂盒

组分 规格 作用说明

试剂一 液体60mL×1瓶 含提取缓冲液，用于提取样本中的AS酶

试剂二 液体30mL×1瓶 含L-天冬酰胺底物溶液

试剂三 液体10mL×1瓶 含奈氏试剂，用于检测反应生成的氨

试剂四 液体6mL×1瓶 含标准品（天冬酰胺合成酶），用于建立标准曲线

提取液 液体100mL×1瓶 含Tris-HCl缓冲液（pH7.4），用于样本提取

ELISA法试剂盒

组分 规格 作用说明

酶标包被板 12孔×8条 预先包被天冬酰胺合成酶（AS）抗体

酶标试剂 液体6mL×1瓶 含HRP标记的天冬酰胺合成酶（AS）检测抗体

标准品 0.3mL×6管 含天冬酰胺合成酶（AS）标准品（0、30、60、120、240、480U/L）

样品稀释液 10mL×1瓶 用于稀释样本和标准品

显色剂A液 6mL×1瓶 含过氧化氢溶液

显色剂B液 6mL×1瓶 含TMB溶液

终止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液

30倍浓缩洗涤液 20mL×1瓶 用于洗涤酶标板

自备仪器与试剂

必备仪器

比色法：可见分光光度计（600nm检测通道）、1mL玻璃比色皿、台式离心机

ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板、37℃恒温箱

通用：低温离心机（≥10000g）、恒温水浴锅、可调式移液器

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、三氯乙酸

样本前处理方法

动植物组织样本取样：称取0.1g新鲜组织，剪碎后置于研钵中研磨：加入1mL提取液，冰浴研磨成匀浆离心：8000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测稀释：若AS酶活性过高，用提取液稀释1-10倍后测定

微生物细胞样本收集：收集500万-1000万细胞，8000g离心5min，弃上清破碎：加入1mL提取液，超声波破碎（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：8000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测

血清/血浆样本采集：空腹采集静脉血，分离血清/血浆保存：4℃可保存3天，-20℃可保存1个月检测：血清样本可直接检测，血浆样本需稀释5倍后测定

细胞培养上清液样本收集：收集细胞培养上清液，3000g离心10min去除细胞碎片保存：4℃可保存24h，-20℃可保存1个月检测：直接检测或稀释后测定

测定操作步骤

比色法操作仪器预热：分光光度计预热30min以上，调节波长至600nm，蒸馏水调零试剂预处理：将试剂二于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min样本测定：

在玻璃比色皿中加入10μL样本、200μL试剂二和40μL试剂三，混匀

记录600nm处20s时吸光值A₁和1min20s后的吸光值A₂，计算ΔA=A₂-A₁

空白对照：以蒸馏水代替样本，同样处理标准曲线绘制：将标准品稀释成0、5、10、20、40、80U/L系列浓度，同样处理

ELISA法操作试剂准备：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用；标准品按说明书稀释成系列浓度加样：

标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL

除空白孔外，每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔温育：37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽，重复洗板5次显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度

结果计算方法

单位定义

U/L：每升样本中AS酶活性单位（1U=1μmol/min）

U/mg protein：每毫克蛋白中AS酶活性单位

mg/L：每升样本中AS酶蛋白含量（ELISA法）

比色法计算公式

AS酶活性(U/g鲜重)=ΔA×V总ε×d×t×V样×mAS酶活性(U/g鲜重)=ε×d×t×V样×mΔA×V总

ΔA：600nm处吸光度变化值

V总：反应体系总体积（L）

ε：棕黄色络合物摩尔消光系数（1.0×10⁴ L/mol/cm）

d：比色皿光径（cm）

t：反应时间（min）

V样：样本体积（L）

m：样本质量（g）

ELISA法计算公式

AS酶含量(mg/L)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数AS酶含量(mg/L)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数

性能指标

指标 比色法 ELISA法

线性范围 0~100U/L 0~480U/L

最低检测限 ≤0.5U/L ≤1.0U/L

回收率 90%~110% 90%~110%

批内精密度 CV≤5.0% CV≤3.0%

批间精密度 CV≤8.0% CV≤5.0%

稳定性 2-8℃保存12个月 2-8℃保存12个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免AS酶活性降解；-80℃可保存数周

组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活

血清样本避免溶血，溶血会导致结果偏高

试剂使用：

酶试剂需避免反复冻融，用后立即放回-20℃保存

奈氏试剂需避光保存，避免分解失效

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

比色法反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）

ELISA法需严格控制温育时间和温度，避免影响显色反应

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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