蔗糖合成酶（分解方向 SSⅠ)测试盒

蔗糖合成酶（分解方向 SSⅠ)测试盒

测定意义与原理

测定意义

蔗糖是源(叶片等)光合产物向"库"器官运输的主要形态。蔗糖合成酶(Sucrose Synthase, EC2.4.1.13)是双向反应酶,既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解,是蔗糖代谢的关键酶之一。研究其分解方向SS-Ⅰ的活性对于植物蔗糖降解以及淀粉合成具有重要意义。

测定原理

SS-Ⅰ催化蔗糖和UDP生成游离果糖和UDPG,采用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖的含量来反映酶活性的高低。反应式如下： 蔗糖+UDP→SS-Ⅰ果糖+UDPG蔗糖+UDPSS-Ⅰ果糖+UDPG 还原糖+3,5-二硝基水杨酸→沸水浴棕红色氨基化合物还原糖+3,5-二硝基水杨酸沸水浴棕红色氨基化合物

试剂盒组成

3,5-二硝基水杨酸比色法/微量法试剂盒

组分 规格 作用说明

提取液 液体100mL×1瓶 用于提取样本中的SS-Ⅰ

试剂一 液体10mL×1瓶 含缓冲液和底物UDP溶液

试剂二 液体5mL×1瓶 含蔗糖溶液

试剂三 粉剂×2支 含3,5-二硝基水杨酸，显色剂；临用前每支加入1.2mL试剂二充分溶解待用，现配现用；-20℃保存

试剂四 液体6mL×1瓶,4℃保存 含反应终止液

标准品 1mL×1支 含还原糖标准液

自备仪器与试剂

必备仪器

3,5-二硝基水杨酸比色法/微量法：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、恒温水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿/96孔板、研钵、电子天平

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器、超声破碎仪

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水

样本前处理方法

植物组织样本取样：称取0.1g样本，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

种子样本取样：称取0.1g种子，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

果实样本取样：称取0.1g果实，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

细胞/微生物样本收集：先收集微生物或细胞到离心管内，离心后弃上清破碎：按照微生物或细胞数量（10⁴个）:提取液体积(mL)为500~1000:1的比例（建议500万微生物或细胞加入1mL提取液），超声波破碎微生物或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

测定操作步骤

3,5-二硝基水杨酸比色法/微量法操作仪器预热：分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零试剂配制：

试剂三工作液：临用前每支加入1.2mL试剂二充分溶解待用，现配现用样本测定：(在EP管中依次加入下列试剂):

试剂名称(μL) 对照管 测定管

蒸馏水/样本 100 100

试剂一 700 700

试剂二 100 100

混匀,37℃准确水浴30min后,95℃水浴10min(盖紧,以防止水分散失),流水冷却后充分混匀(以保证浓度不变)

加入125μL试剂四,混匀,95℃水浴10min(盖紧,以防止水分散失),流水冷却后充分混匀,取200μL至微量石英比色皿或96孔板中,540nm处记录各管吸光值A,如果吸光值大于2,可以用蒸馏水稀释后测定(计算公式中乘以相应稀释倍数),ΔA=A测定-A对照标准曲线绘制：将还原糖标准品稀释成0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL系列浓度，同样处理，测定540nm处的吸光值，绘制标准曲线

结果计算方法

单位定义

U/g FW：每g组织每分钟催化产生1μg还原糖定义为一个酶活力单位。

U/mg prot：每mg组织蛋白每分钟催化产生1μg还原糖定义为一个酶活力单位。

计算公式

SS-Ⅰ活性(U/g FW)=(A测定−A对照)(A标准−A空白)×C标准×V总V1×W×TSS-Ⅰ活性(U/g FW)=(A标准−A空白)(A测定−A对照)×V1×W×TC标准×V总 SS-Ⅰ活性(U/mg prot)=(A测定−A对照)(A标准−A空白)×C标准×V总V1×Cpr×TSS-Ⅰ活性(U/mg prot)=(A标准−A空白)(A测定−A对照)×V1×Cpr×TC标准×V总

A测定：样本管吸光度值

A对照：对照管吸光度值

A标准：标准管吸光度值

A空白：空白管吸光度值

C标准：标准管浓度，通常为1mg/mL

V总：样本提取液总体积，1ml

V1：加入反应体系中样本体积，0.1ml

W：样本鲜重，g

Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml

T：反应时间，30min

性能指标

指标 3,5-二硝基水杨酸比色法/微量法

线性范围 0~1mg/mL

最低检测限 ≤0.01mg/mL

回收率 97%~103.3%

批内精密度 CV≤1.7%

批间精密度 CV≤5.0%

稳定性 4℃保存6-12个月

注意事项

样本处理：

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

样本需新鲜制备,避免SS-Ⅰ失活；-20℃可保存3个月

组织样本需冰浴匀浆,避免酶失活

超声波破碎时需控制功率和时间,避免样本降解

试剂使用：

试剂三工作液需临用前配制,避免氧化失效

不同批号试剂不能混用,需重新绘制标准曲线

标准品需4℃保存,避免反复冻融

测定过程：

沸水浴时间需严格控制在10min,避免颜色过深

显色后需立即测定,避免颜色褪去

若吸光度值超出线性范围,需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器,确保检测结果准确性

若结果偏差较大,需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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