NO含量测试盒 新品

商品属性

测定意义与原理

测定意义

一氧化氮（NO）是一种重要的生物活性分子，具有广泛的生理和病理作用：生理学：参与神经传导、血管舒张、免疫调节等多种生理过程医学：与心血管疾病、神经系统疾病、肿瘤等疾病的发生发展密切相关环境学：是大气污染物之一，影响空气质量和气候变化营养学：反映食品中硝酸盐和亚硝酸盐的含量，评估食品质量和安全性

测定原理

硝酸还原酶法

NO化学性质活泼，体内代谢转化为硝酸盐（NO3ˉ）和亚硝酸盐（NO2ˉ），血清（NO3ˉ）与（NO2ˉ）浓度之和（NO3ˉ+NO2ˉ）才能准确代表体内（NO）水平。本法利用硝酸还原酶特异性将NO3ˉ还原为NO2ˉ，通过显色深浅测定其浓度的高低。

Griess法

NO在体内代谢生成的NO2ˉ可与Griess试剂反应生成有色产物，通过测定吸光度计算NO含量。反应式如下： NO2−+Griess试剂→有色产物NO2−+Griess试剂→有色产物

ELISA法

应用双抗体夹心法测定标本中NO水平。用纯化的NO抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入NO，再与HRP标记的羊抗鼠抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的NO呈正相关。

试剂盒组成

组分 规格 作用说明

试剂一 液体100mL×1瓶 含缓冲液，用于样本提取，-20℃保存

试剂二 液体20mL×1瓶 含反应试剂，-20℃保存

试剂三 液体25mL×1瓶 含反应试剂，室温保存

试剂四 液体25mL×1瓶 含反应试剂，-20℃保存

试剂五 粉剂×1瓶 含显色剂，需临用前加入20mL热蒸馏水溶解，避光保存

试剂六 粉剂×1瓶 含显色剂，需临用前加入8mL蒸馏水溶解，避光冷藏保存

试剂七 液体8mL×1瓶 含显色剂，室温保存

标准品 液体1mL×1支 含10nmol/L NO标准品，用于建立标准曲线，-20℃以下保存

自备仪器与试剂

必备仪器

分光光度法：紫外分光光度计/酶标仪/半自动生化分析仪（比色测定波长为550nm）

ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）

通用：恒温水浴箱或气浴箱（孵育温度为37℃）、漩涡混匀器、台式离心机、微量移液器

组织样本：研钵/组织匀浆器

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、甲苯（不允许快递）

样本前处理方法

血清/血浆样本血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝，3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并使样品均匀地充分解冻。

组织样本动物组织：准确称取0.1g组织，加入1mL试剂一，冰浴匀浆植物组织：称取0.1g组织，加入1mL试剂一，冰浴研磨细胞样本：收集500万细胞，加入1mL试剂一，冰浴超声波破碎离心处理：12000g 4℃离心15min，取上清液置冰上待测样本稀释：若酶活性过高，用提取液稀释1-10倍后测定

尿液/脑脊液样本用无菌管收集样本，离心20分钟左右（2000-3000转/分）仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右，通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份

测定操作步骤

硝酸还原酶法操作试剂准备：按试剂一:试剂二=1:1的比例配制混合试剂，用多少配多少，配好后充分混合后待用；显色剂的配制：试剂五:试剂六:试剂七=1:1:1，需多少配多少样本测定：

按步骤加入样本和R1、R2混合试剂，37℃水浴60分钟

加入R3、R4，抽提室温静置40分钟，3500~4000转/分，离心10分钟

取上清0.5ml，加入显色剂，静置10分钟，550nm波长，0.5cm光径，比色标准曲线：将标准品用蒸馏水稀释成0、0.5、1、2、4、8、16μmol/L系列浓度，同样处理

ELISA法操作标准品的稀释：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为30μmol/L,20μmol/L,10μmol/L,5μmol/L,2.5μmol/L）。加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

结果计算方法

单位定义

μmol/L：样本中一氧化氮的浓度

μmol/g：每克样本中一氧化氮的含量

硝酸还原酶法计算标准曲线绘制：以NO2-浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线NO2-含量计算：根据样品吸光度，在标准曲线上查得NO2-浓度NO总含量计算：NO总含量 = NO2-含量 + NO3-含量（通过硝酸还原酶还原后测定）

ELISA法计算标准曲线绘制：以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线样本NO浓度计算：根据样本OD值，在标准曲线上查得NO浓度，再乘以稀释倍数

性能指标

指标 要求

线性范围 0~16μmol/L，线性相关系数r≥0.995

最低检测限 ≤0.1μmol/L

回收率 90%~110%

批内精密度 CV≤5.0%

批间精密度 CV≤8.0%

稳定性 2-8℃保存12个月，活性保留≥90%

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免NO被氧化失活；-20℃可保存3个月

血清(浆)可直接测定，红细胞需按照试剂盒中说明书上红细胞的测定方法进行提取后测定

动物组织样本可用生理盐水按重量体积比制备成组织匀浆液，离心取上清测定

试剂使用：

混合试剂需现配现用，避免反应失效

显色剂需临用前配制，避光保存，天冷会有结晶析出，再次使用时，放在100℃水浴，反复摇动溶解后使用

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

反应温度需严格控制在37℃，反应时间60分钟

测定需在37℃（哺乳动物）或25℃（植物）条件下进行

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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