亚硝酸还原酶(NiR)测试盒 新品

商品属性

测定意义与原理

测定意义

亚硝酸还原酶（NiR，EC 1.7.2.1/EC 1.7.7.1）是生物体内氮代谢途径中的关键酶，具有重要的生理和应用价值：生物地球化学循环：参与反硝化作用，将亚硝酸盐转化为NO，是氮循环的重要环节环境保护：检测土壤和水体中的NiR活性，评估氮素污染程度微生物学：研究微生物适应环境胁迫的机制，筛选功能微生物农业科学：评估土壤质量，指导合理施肥和农作物栽培食品安全：检测食品中的亚硝酸盐含量，评估食品质量

测定原理

采用比色法测定，NiR可将NO₂⁻还原为NO，使样品中参与重氮化反应生成紫红色偶氮化合物的NO₂⁻减少，即540nm处吸光值的变化可反映亚硝酸还原酶的活性。反应式如下： NO2−+NADH→NiRNO+NAD++OH−NO2−+NADHNiRNO+NAD++OH−

根据酶的不同类型，NiR分为两种类型：铁型亚硝酸还原酶（NiR）：含铁原子，存在于细菌和植物中铜型亚硝酸还原酶（CuNiR）：含铜原子，主要存在于真菌和细菌中

试剂盒组成

分光光度法试剂盒

组分 规格 作用说明

试剂一 液体50mL×1瓶 含0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl缓冲液，提供酶促反应环境

试剂二 液体5mL×1瓶 含亚硝酸盐底物，酶促反应底物

试剂三 粉剂×1瓶 含NADH，需临用前加入4mL蒸馏水溶解

试剂四 液体4mL×1瓶 含终止液，终止酶促反应

试剂五 液体6mL×1瓶 显色剂A液，用于显色反应

试剂六 液体6mL×1瓶 显色剂B液，用于显色反应

标准品 10μmol/mL×1瓶 含标准亚硝酸盐溶液，用于建立标准曲线

ELISA法试剂盒

组分 规格 作用说明

酶标包被板 96T×1盒 已包被NiR单克隆抗体，用于捕获样本中的NiR

标准品 液体1mL×1瓶 含NiR标准品（220ng/L），用于建立标准曲线

酶标试剂 液体6mL×1瓶 含HRP标记的NiR抗体，用于检测结合的NiR

显色剂A 液体6mL×1瓶 含底物过氧化氢溶液，用于显色反应

显色剂B 液体6mL×1瓶 含TMB底物，用于显色反应

终止液 液体6mL×1瓶 含硫酸溶液，终止显色反应

浓缩洗涤液 20mL×1瓶 含0.05%吐温20的PBS溶液，用于洗涤

自备仪器与试剂

必备仪器

分光光度法：可见分光光度计（540nm检测通道）、1mL玻璃比色皿

ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板

通用：低温离心机（≥10000g）、恒温水浴锅、可调式移液器、研钵/组织匀浆器

土壤样本：马弗炉、玛瑙研钵

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、甲苯（不允许快递）

样本前处理方法

动植物组织样本新鲜组织：准确称取0.1g植物组织，加入1mL提取液，冰浴匀浆细胞样本：收集500万细胞，加入1mL提取液，冰浴超声波破碎离心处理：10000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测样本稀释：若酶活性过高，用提取液稀释1-10倍后测定

土壤样本采样：取5-10g新鲜土样，过2mm筛，去除石块和植物残体风干：自然风干后，磨碎过0.25mm筛提取：准确称取1g土样，加入5mL提取液，振荡提取30min过滤：用定量滤纸过滤，滤液即为酶提取液，立即测定或-20℃保存

测定操作步骤

分光光度法操作仪器预热：分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零工作液配制：将试剂五和试剂六按照1:1的比例混合，现配现用酶促反应：

取比色管，加入样本0.5mL + 试剂二0.2mL + 试剂三0.1mL，混匀

37℃水浴反应30min，加入试剂四0.2mL终止反应

对照管：取样本0.5mL + 提取液0.3mL，同样处理显色反应：

向各管加入工作液0.5mL，混匀，室温放置10min

在540nm波长下测定各管吸光度

以空白管调零，读取样本管吸光度值标准曲线：将标准品稀释成0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625μmol/mL系列浓度，同样处理

ELISA法操作试剂平衡：试剂盒从冰箱取出，室温平衡15-30min标准品稀释：将标准品稀释成6ng/L-220ng/L系列浓度加样：取96孔板，加入标准品/样本50μL + HRP标记检测抗体100μL，37℃温育30min洗涤：弃去液体，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，重复5次，拍干显色：每孔加入显色剂A、B各50μL，37℃避光孵育10min终止：每孔加入终止液50μL，终止反应（蓝色立转黄色）测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）

结果计算方法

单位定义

U/g 鲜重：每克组织每分钟还原1μmol亚硝酸盐的酶量

U/mg 蛋白：每毫克组织蛋白每分钟还原1μmol亚硝酸盐的酶量

U/g 干土：每克干土每天还原1μmol亚硝酸盐的酶量

分光光度法计算公式

NiR酶活性(U/g鲜重)=[A空白−(A测定−A对照)−0.0088]×V标k×W×TNiR酶活性(U/g鲜重)=k×W×T[A空白−(A测定−A对照)−0.0088]×V标

A空白：空白管吸光度值

A测定：测定管吸光度值

A对照：对照管吸光度值

V标：标准品体积（L）

k：标准曲线斜率（1.5562）

W：样本质量（g）

T：反应时间（d）

ELISA法计算公式

以标准品浓度为x轴，OD值为y轴，绘制标准曲线，回归方程为：y=0.0119x+0.0021，R²=0.9997 根据样本OD值，通过标准曲线计算样本中NiR的浓度

性能指标

指标 要求

线性范围 分光光度法：0.015625~0.5μmol/L；ELISA法：6ng/L~220ng/L

最低检测限 分光光度法：≤0.01μmol/L；ELISA法：≤3ng/L

回收率 90%~110%

批内精密度 CV≤5.0%

批间精密度 CV≤8.0%

稳定性 2-8℃保存12个月，活性保留≥90%

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免酶活性失活；-20℃可保存3个月

组织样本需洗净血液并擦干后称重，避免血液干扰

土壤样本需自然风干后磨碎，避免高温和强酸强碱处理

试剂使用：

工作液需现配现用，常温下12h内用完

NADH对光敏感，需避光保存，避免反复冻融

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）

吸光度测定需在5min内完成，避免NADH自动氧化

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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