类黄酮糖基转移酶(UFGT）测试盒

商品属性

测定意义与原理

测定意义

类黄酮糖基转移酶（UFGT）是植物类黄酮生物合成途径的关键酶，具有重要的生理功能和应用价值：植物呈色调控：催化不稳定花色素转化为稳定花色苷，决定植物花色、果色等色泽抗氧化活性：提高类黄酮的水溶性和稳定性，增强植物抗氧化能力抗逆性增强：参与植物对干旱、低温、病虫害等逆境胁迫的响应果实品质：影响果实色泽、风味、营养价值和货架期植物育种：作为选育高花色苷含量品种的重要指标

测定原理

采用偶联酶法，UFGT催化UDP-葡萄糖与槲皮素生成UDP，UDP在丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶作用下氧化NADH为NAD+，NAD+生成速度与UDP含量成正比，通过340nm吸光度下降速度反映UFGT活性。反应式如下： UDP-葡萄糖+槲皮素→UFGT槲皮素糖苷+UDPUDP-葡萄糖+槲皮素UFGT槲皮素糖苷+UDP UDP+磷酸烯醇式丙酮酸→丙酮酸激酶UTP+丙酮酸UDP+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶UTP+丙酮酸 丙酮酸+NADH+H+→乳酸脱氢酶乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+乳酸脱氢酶乳酸+NAD+

试剂盒组成

组分 规格 作用说明

试剂一 液体60mL×1瓶 含0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl缓冲液，提供酶促反应环境

试剂二 粉剂×1瓶 含槲皮素底物，需临用前加入20mL蒸馏水溶解

试剂三 粉剂×1瓶 含UDP-葡萄糖，需临用前加入10mL蒸馏水溶解

试剂四 液体20mL×1瓶 含偶联酶混合液，需临用前加入10mL蒸馏水溶解

提取液 液体30mL×1瓶 含缓冲液，用于植物样本提取

标准品 液体1mL×1支 含0.1U/mL UFGT标准品，用于校准和验证

自备仪器与试剂

必备仪器

紫外分光光度计/酶标仪（340nm检测通道）

低温离心机（≥12000g）

恒温水浴锅/金属浴（控温精度±0.5℃）

可调式移液器（10-1000μL）

组织匀浆器/研钵

超声波破碎仪

必备耗材

离心管（1.5mL、10mL）、一次性吸头、手术剪/镊子

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水

样本前处理方法

植物组织样本取新鲜植物组织约0.1g，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分加入1mL提取液，冰浴匀浆12000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测若酶活性过高，用提取液稀释1-10倍后测定

细胞样本收集500万对数生长期细胞，8000g 4℃离心5min弃上清加入1mL提取液，冰浴超声波破碎（功率20%或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次）12000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测

果实样本取新鲜果实约0.5g，去皮去核，加入1mL提取液冰浴匀浆12000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测若酶活性过高，用提取液稀释1-10倍后测定

测定操作步骤

试剂配制工作液配制：取试剂一20mL + 试剂二0.2mL + 试剂三0.2mL + 试剂四0.5mL，混匀（现配现用）标准品稀释：将0.1U/mL UFGT标准品用提取液稀释成0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1U/mL系列浓度

标准曲线建立取比色管，加入标准品溶液0.2mL + 工作液0.8mL，立即混匀340nm波长下测定初始吸光值A1和10min后的吸光值A2，计算ΔA = A1 - A2以UFGT浓度为横坐标，ΔA为纵坐标，绘制标准曲线

样本测定反应体系：取样本0.2mL + 工作液0.8mL，立即混匀吸光度测定：340nm波长下测定初始吸光值A1和10min后的吸光值A2，计算ΔA = A1 - A2空白对照：取提取液0.2mL + 工作液0.8mL，同样处理作为空白计算ΔA：ΔA = (A1-A2)样本 - (A1-A2)空白

ELISA法操作取96孔板，加入标准品/样本50μL + HRP标记检测抗体100μL，37℃温育60min弃去液体，洗涤5次，每次300μL加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min加入终止液50μL，15min内在450nm波长下测定吸光度

结果计算方法

单位定义

U/mgprot：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol UDP的酶量

U/g鲜重：每g组织每分钟生成1nmol UDP的酶量

U/10⁴cell：每10⁴个细胞每分钟生成1nmol UDP的酶量

计算公式

UFGT酶活(U/mgprot)=ΔA×V反总ε×d×t×Cpr×V样×109UFGT酶活(U/mgprot)=ε×d×t×Cpr×V样ΔA×V反总×109

ΔA：340nm处吸光度变化值

V反总：反应体系总体积（L）

ε：NADH摩尔消光系数（6.22×10³ L/mol/cm）

d：比色皿光径（cm）

t：反应时间（min）

Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）

V样：样本加入体积（L）

ELISA法计算绘制标准曲线：以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标计算样本浓度：将样本吸光度代入标准曲线回归方程，计算UFGT浓度结果换算：UFGT活性（U/L）= 样本浓度（ng/mL）× 换算系数（根据试剂盒说明书）

性能指标

指标 要求

线性范围 0~0.1U/mL UFGT，线性相关系数r≥0.995

最低检测限 ≤0.005U/mL

回收率 90%~110%

批内精密度 CV≤5.0%

批间精密度 CV≤8.0%

稳定性 2-8℃保存12个月，活性保留≥90%

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免酶活性失活；-80℃可保存1个月

提取过程需在冰浴中进行，防止UFGT失活

样本处理需避免光照，防止槲皮素降解

试剂使用：

UDP-葡萄糖溶液需现配现用，或分装-20℃避光保存

底物溶液需临用前配制，避免分解

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

反应时间需严格控制，保持线性范围内的吸光度变化

测定需在37℃（哺乳动物）或25℃（植物）条件下进行

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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