二氢黄酮醇还原酶（DFR）测试盒 新品

商品属性

测定意义与原理

测定意义

二氢黄酮醇还原酶（DFR）是类黄酮合成途径中的关键酶，其测定具有重要的实际意义：植物生理学：决定植物花色、叶色、果色等性状的关键因素食品科学：影响水果、蔬菜、茶叶等的色泽和营养品质生物技术：用于植物基因工程和代谢工程研究农业生产：培育高黄酮含量作物和观赏植物新品种医药研究：黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等活性

测定原理

二氢黄酮醇还原酶作用于二氢槲皮素产生儿茶素，可与香草醛缩合形成红色化合物，在500nm处有最大吸收峰，吸光度与酶活性成正比。反应式如下： 二氢槲皮素+NADPH→DFR儿茶素+NADP++H2O二氢槲皮素+NADPHDFR儿茶素+NADP++H2O

试剂盒组成

组分 规格 作用说明

试剂一 液体100mL×1瓶 含0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl缓冲液，提供酶促反应环境

试剂二 液体10mL×1瓶 含2mmol/L二氢槲皮素溶液，酶促反应底物

试剂三 液体1.5mL×1瓶 含10mmol/L NADPH溶液，酶促反应辅因子

试剂四 液体25mL×1瓶 含5%香草醛溶液，显色反应试剂

试剂五 液体25mL×1瓶 含浓盐酸，显色反应试剂

标准品 粉剂×1支 含10mg儿茶素标准品，用于建立标准曲线

自备仪器与试剂

必备仪器

分光光度法：可见分光光度计（500nm、340nm检测通道）、1mL玻璃比色皿

微量法：酶标仪（500nm、340nm检测通道）、96孔板

ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板

通用：低温离心机（≥10000g）、恒温水浴锅、可调式移液器、研钵/组织匀浆器

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl缓冲液

样本前处理方法

植物组织样本取新鲜植物组织约0.1g，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分加入1mL 0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl缓冲液，冰浴匀浆10000g 4℃离心10min，取上清液作为粗酶液直接测定

微生物发酵液样本取发酵液10000g 4℃离心10min，取上清液作为粗酶液直接测定若酶活性过高，用试剂一稀释1-10倍后测定样本可-20℃保存3个月，避免反复冻融

食品样本茶叶：取干燥茶叶0.05g，加入1mL 0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl缓冲液，40℃水浴浸提30min水果/蔬菜：取样本0.1g，加入1mL 0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl缓冲液，冰浴匀浆10000g 4℃离心10min，取上清液作为粗酶液直接测定

细胞样本收集500万对数生长期细胞，8000g 4℃离心5min弃上清加入1mL 0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl缓冲液，冰浴超声波破碎（功率20%或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次）10000g 4℃离心10min，取上清液作为粗酶液直接测定

测定操作步骤

分光光度法操作

酶促反应：

取比色管，加入样本0.5mL + 试剂二0.2mL + 试剂三0.1mL，混匀

37℃水浴反应30min

空白对照：取样本0.5mL + 试剂一0.3mL，同样处理

显色反应：

向各管加入试剂四0.2mL + 试剂五0.2mL，涡旋混匀，室温静置15min

在500nm波长下测定各管吸光度

ELISA法操作样本处理：将样本稀释至合适浓度（5-160U/mL）加样：取96孔板，加入标准品/样本50μL + HRP标记检测抗体100μL，37℃温育60min洗涤：弃去液体，洗涤5次，每次300μL显色：加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：加入终止液50μL，15min内在450nm波长下测定吸光度

结果计算方法

单位定义

U/g 鲜重：每克植物组织鲜重中DFR酶的活性

U/L：每毫升发酵液/血清中DFR酶的活性

U/mg prot：每毫克蛋白质中DFR酶的活性

计算公式

DFR酶活性(U/g鲜重)=(A样−A空)×C标×V总(A标−A空标)×t×WDFR酶活性(U/g鲜重)=(A标−A空标)×t×W(A样−A空)×C标×V总

A样-A空：样本扣除空白后的吸光度值

C标：标准品浓度（μmol/mL）

V总：样本提取液总体积（mL）

A标-A空标：标准品扣除空白后的吸光度值

t：反应时间（min）

W：样本质量（g）

ELISA法计算绘制标准曲线：以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标计算样本浓度：将样本吸光度代入标准曲线回归方程，计算DFR浓度结果换算：DFR活性（U/L）= 样本浓度（ng/mL）× 换算系数（根据试剂盒说明书）

性能指标

指标 要求

线性范围 0~10μmol/L儿茶素当量，线性相关系数r≥0.995

最低检测限 ≤0.01U/g鲜重

回收率 90%~110%

批内精密度 CV≤5.0%

批间精密度 CV≤8.0%

稳定性 2-8℃保存12个月，活性保留≥90%

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免酶活性失活；-20℃可保存3个月

酶提取液需用pH7.5 Tris-HCl缓冲液，避免过酸或过碱影响酶活性

样本中不能添加重金属离子，以免抑制酶活性

试剂使用：

NADPH溶液需现配现用，避免氧化

香草醛溶液需避光保存，避免分解

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

反应温度需严格控制在37℃，反应时间30min

显色反应后需立即测定，2小时后吸光度值会下降

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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