非蛋白质巯基测试盒 新品

商品属性

测定意义与原理

测定意义

非蛋白质巯基（NP-SH）是生物体内重要的小分子抗氧化剂，具有多种生理功能：抗氧化作用：清除自由基，保护细胞免受氧化损伤金属解毒：与重金属结合，促进其排出体外细胞信号传导：参与细胞内氧化还原信号调节疾病诊断：与心血管疾病、糖尿病、肿瘤等密切相关环境毒理：作为重金属污染和氧化应激的生物标志物

测定原理

采用Ellman法，利用三氯乙酸（TCA）沉淀蛋白质，游离的非蛋白质巯基留在上清液中，与Ellman试剂（DTNB）反应生成黄色的2-硝基-5-硫代苯甲酸（TNB⁻），在412nm处有最大吸收峰，吸光度与非蛋白质巯基含量成正比。反应式如下： NP-SH+DTNB→NP-S-S-TNB+TNB−(黄色)NP-SH+DTNB→NP-S-S-TNB+TNB−(黄色)

试剂盒组成

组分 规格 作用说明

试剂A 液体100mL×1瓶 含0.1mol/L磷酸缓冲液，pH8.0，提供反应环境

试剂B 液体20mL×1瓶 含10mmol/L DTNB溶液，显色剂，与巯基反应产生黄色化合物

试剂C 液体100mL×1瓶 含10%三氯乙酸（TCA），用于蛋白质沉淀

标准品 液体1mL×1支 含10mmol/L谷胱甘肽（GSH）标准品，用于建立标准曲线

提取液 液体100mL×1瓶 含0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4，用于动植物组织和细胞样本提取

自备仪器与试剂

必备仪器

分光光度法：可见分光光度计（412nm检测通道）、1mL玻璃比色皿

微量法：酶标仪（412nm检测通道）、96孔板

通用：低温离心机（≥12000g）、恒温水浴锅、可调式移液器、漩涡混匀器

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、抗凝剂（肝素/柠檬酸钠）

样本前处理方法

动植物组织样本取新鲜组织约0.1g，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分加入1mL提取液，冰浴匀浆，室温静置10min10000g 4℃离心10min，取上清液1mL加入1mL试剂C，混匀室温静置10min，12000g 4℃离心10min，取上清液用试剂A稀释1-10倍后测定

细胞样本收集500万对数生长期细胞，8000g 4℃离心5min弃上清加入1mL提取液，冰浴超声波破碎（功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）10000g 4℃离心10min，取上清液1mL加入1mL试剂C，混匀室温静置10min，12000g 4℃离心10min，取上清液用试剂A稀释1-10倍后测定

血清/血浆样本血清样本：血液凝固后3000g 4℃离心10min，取上清直接测定或-80℃保存血浆样本：用肝素/柠檬酸钠抗凝，5000g 4℃离心10min，取上清直接测定样本避免溶血，溶血会导致结果偏高

尿液样本取新鲜尿液，3000g 4℃离心10min，取上清液直接测定若非蛋白质巯基含量过高，可用试剂A稀释1-10倍后测定样本可-80℃保存1个月，解冻后离心取上清

测定操作步骤

标准曲线建立将10mmol/L谷胱甘肽标准品用试剂A稀释成0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0mmol/L系列浓度取比色管/96孔板，加入标准品溶液0.2mL + 试剂B 0.05mL，混匀37℃水浴反应10min，412nm波长下测定吸光度以巯基浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线

样本测定工作液配制：取试剂B 1mL + 试剂A 4mL，混匀即为工作液（现配现用）样本处理：取样本0.2mL + 工作液0.05mL，混匀反应与测定：37℃水浴反应10min，412nm波长下测定吸光度空白对照：取试剂A 0.2mL + 工作液0.05mL，同样处理

结果计算方法

单位定义

μmol/g 鲜重：每克组织鲜重中非蛋白质巯基的含量

μmol/L：每毫升血清/血浆中非蛋白质巯基的含量

μmol/mgprot：每毫克蛋白中非蛋白质巯基的含量

计算公式

非蛋白质巯基含量(μmol/g鲜重)=(A样−A空)×C标×V总(A标−A空标)×W非蛋白质巯基含量(μmol/g鲜重)=(A标−A空标)×W(A样−A空)×C标×V总

A样-A空：样本扣除空白后的吸光度值

C标：标准品浓度（μmol/L）

V总：样本提取液总体积（mL）

A标-A空标：标准品扣除空白后的吸光度值

W：样本质量（g）

简化公式

按体积计算：非蛋白质巯基（μmol/L）= C标 × (A样-A空)/(A标-A空标)

按鲜重计算：非蛋白质巯基（μmol/g鲜重）= C标 × (A样-A空)/(A标-A空标) × V总/W

性能指标

指标 要求

线性范围 0~2μmol/L谷胱甘肽当量，线性相关系数r≥0.995

最低检测限 ≤0.05μmol/L

回收率 90%~110%

批内精密度 CV≤5.0%

批间精密度 CV≤8.0%

稳定性 2-8℃保存12个月，活性保留≥90%

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免巯基氧化；-80℃可保存1个月

提取液含三氯乙酸，需在通风橱中操作，避免接触皮肤和眼睛

样本中不能添加巯基乙醇、DTT等还原剂，以免干扰测定

试剂使用：

DTNB溶液对光敏感，需避光保存，现配现用

标准品需现配现用，避免氧化失效

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

反应温度需严格控制在37℃，反应时间10min

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

每个样本需设置至少3个平行实验，结果取平均值

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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