羟自由基清除能力测试盒 新品

商品属性

测定意义与原理

测定意义

羟自由基（·OH）是活性最强的氧自由基之一，羟自由基清除能力反映样品的抗氧化水平，其生理与临床意义包括：氧化损伤评估：·OH能直接氧化蛋白质、核酸和脂质，导致细胞结构和功能损伤，与多种疾病密切相关疾病诊断：与糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病、癌症等发病机制密切相关衰老评价：·OH生成过多是衰老进程加速的重要原因之一药物研发：筛选具有抗氧化活性的天然药物成分，开发新型抗氧化剂食品科学：评估食品的抗氧化能力，指导功能性食品开发

测定原理

采用Fenton反应体系，H₂O₂和Fe²⁺通过Fenton反应产生羟自由基（·OH），将邻二氮菲-Fe²⁺水溶液中的Fe²⁺氧化为Fe³⁺，导致536nm波长处吸光度下降。样品对吸光度下降速率的抑制程度，反映了样品清除羟自由基的能力。反应式如下： H2O2+Fe2+→\cdotpOH+OH−+Fe3+H2O2+Fe2+→\cdotpOH+OH−+Fe3+ 邻二氮菲-Fe2++\cdotpOH→邻二氮菲-Fe3++OH−邻二氮菲-Fe2++\cdotpOH→邻二氮菲-Fe3++OH−

试剂盒组成

组分 规格 作用说明

提取液 液体50mL×1瓶 含磷酸缓冲液，用于动植物组织、细胞样本的提取

试剂一 液体8mL×1瓶 含邻二氮菲溶液，与Fe²⁺形成有色络合物

试剂二 液体20mL×1瓶 含FeSO₄溶液，提供Fenton反应所需的Fe²⁺离子

试剂四 液体5mL×1瓶 含H₂O₂溶液，提供Fenton反应所需的H₂O₂

标准品 液体1.5mL×1支 含标准酪氨酸溶液（0.05mg/mL），用于建立标准曲线

自备仪器与试剂

必备仪器

分光光度法：可见分光光度计、台式高速离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、漩涡混匀器

微量法：酶标仪、96孔板、恒温水浴锅、低温离心机

通用：-20℃冰箱、电子天平、恒温水浴锅

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、抗凝剂（肝素/柠檬酸钠）

样本前处理方法

动植物组织样本取新鲜组织，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分按质量(g):提取液(mL)=1:5~10比例（建议0.1g组织加1mL提取液）冰浴匀浆10000g 4℃离心10min，取上清置冰上待测若羟自由基清除能力过高，可用提取液稀释1-10倍测定

细胞/细菌样本收集对数生长期细胞/细菌，8000g 4℃离心5min弃上清按照细胞数(10⁴个):提取液体积(mL)=500~1000:1比例加入提取液，冰浴超声波破碎（功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）10000g 4℃离心10min，取上清置冰上待测

血清/血浆样本血清样本：血液凝固后3000g 4℃离心10min，取上清直接测定血浆样本：加入肝素/柠檬酸钠抗凝后，3000g 4℃离心10min，取上清直接测定不宜使用EDTA抗凝，避免干扰Fe²⁺离子

食品/化妆品样本液态样本：如果汁、饮料、化妆品溶液，可直接测定固态样本：磨碎后加入5-10倍体积的生理盐水，搅拌均匀后过滤，取上清测定提取物：将提取物配制成一定浓度（如5mg/mL）的溶液后测定

测定操作步骤

分光光度法操作

试剂准备：

将试剂盒所有组分平衡至室温（20-25℃）

标准品稀释：将0.05mg/mL标准酪氨酸溶液用蒸馏水稀释成系列浓度

标准曲线建立：

取比色管，加入标准品溶液0.1mL + 试剂一0.2mL + 蒸馏水0.7mL，混匀

加入试剂二0.1mL，混匀，37℃水浴5min

加入试剂四0.1mL，混匀，37℃水浴15min

536nm波长下测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线

样本测定：

测定管：样本0.1mL + 试剂一0.2mL + 蒸馏水0.6mL，混匀，37℃水浴5min

对照管：蒸馏水0.1mL + 试剂一0.2mL + 蒸馏水0.6mL，混匀，37℃水浴5min

空白管：样本0.1mL + 试剂一0.2mL + 蒸馏水0.7mL，混匀，37℃水浴5min

向测定管和对照管加入试剂二0.1mL，混匀，37℃水浴5min

加入试剂四0.1mL，混匀，37℃水浴15min

536nm波长下测定吸光度（A样、A对、A空）

微量法（酶标仪）操作96孔板每孔加入：样本10μL + 试剂一20μL + 蒸馏水60μL，混匀37℃恒温孵育5min，加入试剂二10μL，混匀，37℃孵育5min加入试剂四10μL，混匀，37℃孵育15min酶标仪536nm波长下读取吸光度，计算羟自由基清除率

结果计算方法

单位定义

清除率（%）：样本清除羟自由基的百分比

μg/mL当量：每毫升样本相当于标准酪氨酸的清除能力

计算公式

羟自由基清除率(%)=OD测定管−OD对照管OD空白管−OD对照管×100%羟自由基清除率(%)=OD空白管−OD对照管OD测定管−OD对照管×100%

OD测定管：加入样本和H₂O₂的吸光度值

OD对照管：未加入样本，仅加入H₂O₂的吸光度值

OD空白管：加入样本，但未加入H₂O₂的吸光度值

按标准品计算清除能力

清除能力(μg/mL当量)=OD空白管−OD测定管OD空白管−OD标准管×C标清除能力(μg/mL当量)=OD空白管−OD标准管OD空白管−OD测定管×C标

C标：标准品浓度（μg/mL）

性能指标

指标 要求

线性范围 0~100μg/mL酪氨酸当量，线性相关系数r≥0.995

最低检测限 ≤1μg/mL

回收率 90%~110%

批内精密度 CV≤5.0%

批间精密度 CV≤8.0%

稳定性 2-8℃保存12个月，活性保留≥90%

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免抗氧化物质失活；-80℃可保存1个月

组织匀浆与超声破碎需在冰浴中进行，控制温度在0-4℃

血清样本应避免溶血，溶血会导致结果偏高

试剂使用：

试剂对光敏感，配制后需避光保存

标准品需现配现用，避免分解

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

反应温度需严格控制在37℃

反应时间需准确控制，避免反应过度或不完全

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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