ADPG焦磷酸化酶(AGP）测试盒 新品

ADPG焦磷酸化酶(AGP）测试盒

测定意义与原理

测定意义

ADPG焦磷酸化酶（AGP，EC2.7.7.21）主要存在于植物中，催化葡萄糖-1-磷酸与ATP反应生成淀粉合成的直接前体ADPG，是植物淀粉生物合成的主要限速步骤。其活性检测具有重要意义：植物生理学研究：了解植物淀粉合成机制、碳水化合物代谢途径和碳分配调控机制农业应用：提高作物淀粉含量、改良作物品质和产量基础科学研究：研究植物生长发育、抗逆性机制和环境胁迫响应食品工业：控制食品加工过程和质量

测定原理

紫外分光光度法：AGP催化的逆向反应生成G1P，在反应体系中添加的磷酸己糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，340nm下测定NADPH增加速率，即可计算AGP活性。反应式如下： ADPG+Pi→AGPG1P+ATPADPG+PiAGPG1P+ATP G1P→磷酸己糖变位酶G6PG1P磷酸己糖变位酶G6P G6P+NADP+→6-磷酸葡萄糖脱氢酶6-磷酸葡萄糖酸+NADPH+H+G6P+NADP+6-磷酸葡萄糖脱氢酶6-磷酸葡萄糖酸+NADPH+H+

ELISA法：采用双抗体夹心法，将AGP与特异性抗体结合，通过酶标二抗检测结合的AGP，根据吸光度值计算AGP含量。

试剂盒组成

紫外分光光度法试剂盒

组分 规格 作用说明

提取液 液体60mL×1瓶 用于提取样本中的AGP

试剂一 液体45mL×1瓶 含缓冲液、底物ADPG溶液

试剂二 粉剂×1支 含磷酸己糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶

试剂三 粉剂×1支 含NADP溶液

标准品 1mL×1支 含G1P标准液

ELISA法试剂盒

组分 规格 作用说明

包被板 96孔×1块 预包被抗AGP单克隆抗体

酶标抗体 液体6mL×1瓶 含HRP标记抗AGP抗体

标准品 液体1mL×6管 含12.5-400U/L AGP标准品

样本稀释液 10mL×1瓶 用于稀释样本和标准品

显色剂A液 6mL×1瓶 含过氧化氢溶液

显色剂B液 6mL×1瓶 含TMB溶液

终止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液

20倍浓缩洗涤液 20mL×1瓶 用于洗涤酶标板

自备仪器与试剂

必备仪器

紫外分光光度法：紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、恒温水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿/96孔板、研钵、电子天平

ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板、37℃恒温箱、洗板机、可调式移液器、台式离心机

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器、超声破碎仪

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水

样本前处理方法

植物组织样本取样：将组织加入适量生理盐水捣碎匀浆：按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆离心：8000g 4℃离心10分钟取上清保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20°C，避免反复冻融

血清/血浆样本采集：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20°C，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻处理：直接检测。

细胞/微生物样本收集：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清破碎：按照细菌或细胞数量（10⁴个）:提取液体积(mL)为500~1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

测定操作步骤

紫外分光光度法操作仪器预热：紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到340nm，蒸馏水调零试剂配制：

试剂二：临用前加入1.5mL蒸馏水充分溶解备用

试剂三：临用前加入1.5mL蒸馏水充分溶解备用样本测定：

试剂名称(μL) 空白管 测定管

蒸馏水/样本 100 100

试剂一 700 700

试剂二 100 100

试剂三 100 100

混匀后立即记录340nm处反应0min时的吸光值A0和5min时的吸光值A5，计算ΔA=A5-A0标准曲线绘制：将G1P标准品稀释成0、10、20、30、40、50μmol/L系列浓度，同样处理，测定5min内吸光度变化，绘制标准曲线

ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度

结果计算方法

单位定义

U/mL：每毫升样本每分钟催化水解1μmol ADPG的酶量

U/mg prot：每毫克组织蛋白每分钟催化水解1μmol ADPG的酶量

U/g 鲜重：每克组织每分钟催化水解1μmol ADPG的酶量

紫外分光光度法计算公式

AGP活性(U/mL)=ΔA×V总ε×d×T×V样×106AGP活性(U/mL)=ε×d×T×V样ΔA×V总×106

ΔA：样本管吸光度变化值

V总：反应体系总体积（L）

ε：NADPH摩尔消光系数（6.22×10³ L/mol/cm）

d：比色皿光径（cm）

T：反应时间（min）

V样：样本体积（L）

ELISA法计算公式

AGP含量(U/L)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数AGP含量(U/L)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数

性能指标

指标 紫外分光光度法 ELISA法

线性范围 0~50μmol/L 12.5-400U/L

最低检测限 ≤0.1μmol/L ≤6.25U/L

回收率 90%~110% 90%~110%

批内精密度 CV≤2.2% CV≤3.8%

批间精密度 CV≤5.0% CV≤8.5%

稳定性 -20℃保存6-12个月 -20℃保存6-12个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免AGP失活；-20℃可保存3个月

组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活

超声波破碎时需控制功率和时间，避免样本降解

试剂使用：

试剂需临用前配制，避免氧化失效

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

标准品需4℃保存，避免反复冻融

测定过程：

反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）

加入样品启动反应后3秒内即刻比色测定

比色测定初始读数(0分钟读数)0.4左右为理想状态

反应1分钟后比色测定值趋于稳定；测定值由高到低变化；测定可以持续5分钟

测定值由高到低变化，即5分钟测定读数低于0分钟测定读数，表明有酶活性

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

其他注意事项：

反应液(Reagent B)含有毒性物质，避免直接用手接触

比色测定后，比色皿须清洗彻底

如果增强酶活检测，建议使用线粒体复合物待测样品预处理试剂盒

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