ATP柠檬酸裂解酶（ACL）测试盒 新品

ATP柠檬酸裂解酶（ACL）测试盒

测定意义与原理

测定意义

ATP柠檬酸裂解酶（ACL，EC4.1.3.8）是脂肪酸合成中的关键酶，其催化产生的乙酰辅酶A可用于脂肪酸合成和碳链延长、黄酮类物质合成、氨基酸合成等。其活性检测具有重要意义：

疾病研究：研究肥胖、糖尿病、脂肪肝、心血管疾病等代谢性疾病的发病机制

药物研发：筛选ACL抑制剂，用于治疗肥胖、糖尿病、癌症等疾病

基础研究：了解脂肪代谢途径、能量代谢调控和细胞信号传导机制

农业研究：研究植物抗逆性机制、脂肪酸合成和品质改良

测定原理

ACL在ATP和辅酶A存在的情况下催化柠檬酸裂解为乙酰辅酶A、草酰乙酸、腺苷二磷酸和磷酸盐。苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+，在340nm测定NADH减少速率，计算ACL活性。

试剂盒组成

分光光度法/紫外分光光度法/微量法/酶标法试剂盒

组分 规格 作用说明

提取液 液体60mL×1瓶 用于提取样本中的ACL

试剂一 液体45mL×1瓶 含反应缓冲液，用于提供适宜的反应pH环境

试剂二 粉剂×1瓶 含柠檬酸、ATP和CoA，反应底物

试剂三 粉剂×1瓶 含苹果酸脱氢酶和NADH

标准品 1mL×1支 含ACL标准液，用于建立标准曲线

自备仪器与试剂

必备仪器

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水

可选仪器：超声破碎仪、组织匀浆器

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器、超声破碎仪

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水

样本前处理方法

细菌或培养细胞样本

收集：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清

破碎：按照细菌或细胞数量（10⁴个）:提取液体积(mL)为500~1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）

离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

组织样本

取样：按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆

离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

血清/血浆样本

采集：采集血液，静置1-2小时（血清）或使用抗凝剂（血浆）

离心：3000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

检测：直接检测

测定操作步骤

仪器预热：紫外分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm，蒸馏水调零

试剂配制：

试剂二：临用前加入1.5mL蒸馏水充分溶解备用

试剂三：临用前加入1.5mL蒸馏水充分溶解备用

样本测定：

试剂名称(μL) 空白管 测定管

蒸馏水/样本 100 100

试剂一 700 700

试剂二 100 100

试剂三 100 100

混匀后立即记录340nm处反应5min时的吸光值A1和10min时的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1

标准曲线绘制：将ACL标准品稀释成0、10、20、30、40、50U/L系列浓度，同样处理，测定10min内吸光度变化，绘制标准曲线

结果计算方法

单位定义

U/mL：每毫升样本每分钟生成1μmol乙酰-CoA的酶量

U/mg prot：每毫克组织蛋白每分钟生成1μmol乙酰-CoA的酶量

U/g 鲜重：每克组织每分钟生成1μmol乙酰-CoA的酶量

性能指标

指标 分光光度法/紫外分光光度法/微量法/酶标法

线性范围 0~50U/L

最低检测限 ≤0.1U/L

回收率 90%~110%

批内精密度 CV≤2.0%

批间精密度 CV≤5.0%

稳定性 -20℃保存6-12个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免ACL失活；-20℃可保存3个月

组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活

超声波破碎时需控制功率和时间，避免样本降解

加入样品启动反应后3秒内即刻比色测定

试剂使用：

试剂需临用前配制，避免氧化失效

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

标准品需4℃保存，避免反复冻融

测定过程：

反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）

比色测定初始读数（0分钟读数）0.4左右为理想状态

反应1分钟后比色测定值趋于稳定；测定值由高到低变化；测定可以持续5分钟

测定值由高到低变化，即5分钟测定读数低于0分钟测定读数，表明有酶活性

比色测定后，比色皿须清洗彻底

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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