磷脂酶A2（PLA2）测试盒 新品

磷脂酶A2（PLA2）测试盒

测定意义与原理

测定意义

磷脂酶A₂（PLA₂）即磷脂酰胆碱2-酰基水解酶，是催化甘油磷脂sn-2位酯键水解，生成游离脂肪酸和溶血磷脂的一类酶的总称，是膜磷脂分解代谢的关键酶之一。其活性检测具有重要意义：临床诊断：诊断和监测急性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺癌等疾病疾病监测：评估炎症状态、急性胰腺炎预后和治疗效果生物学研究：了解炎症反应机制、细胞信号传导和细胞凋亡途径药物研发：筛选PLA₂抑制剂，用于治疗炎症、心血管疾病等植物学研究：研究植物抗逆性机制、信号转导途径和防御反应

测定原理

比色法/酶标法/微量法：PLA₂催化水解磷脂酰胆碱2-位酯键生成游离脂肪酸和溶血磷脂，通过偶联酶反应生成NADH，测定340nm处吸光度变化速率以确定PLA₂活性。反应式如下： 磷脂酰胆碱→PLA2溶血磷脂+游离脂肪酸磷脂酰胆碱PLA2溶血磷脂+游离脂肪酸 游离脂肪酸+ATP→酰基-CoA合成酶酰基-CoA+AMP+PPi游离脂肪酸+ATP酰基-CoA合成酶酰基-CoA+AMP+PPi 酰基-CoA+CoA→酰基-CoA氧化酶反式-2-烯酰-CoA+H2O2酰基-CoA+CoA酰基-CoA氧化酶反式-2-烯酰-CoA+H2O2 H2O2+AH2→过氧化物酶A+2H2OH2O2+AH2过氧化物酶A+2H2O

ELISA法：采用双抗体夹心法，将PLA₂与特异性抗体结合，通过酶标二抗检测结合的PLA₂，根据吸光度值计算PLA₂含量。

试剂盒组成

比色法/酶标法/微量法试剂盒

组分 规格 作用说明

缓冲液 液体50mL×1瓶 用于提供适宜的反应pH环境

底物缓冲液 液体20mL×1瓶 用于溶解底物

底物 粉剂×1支 含磷脂酰胆碱，反应底物

试剂一 液体10mL×1瓶 含酰基-CoA合成酶，用于催化游离脂肪酸生成酰基-CoA

试剂二 液体10mL×1瓶 含酰基-CoA氧化酶，用于催化酰基-CoA生成反式-2-烯酰-CoA和H₂O₂

试剂三 液体10mL×1瓶 含过氧化物酶和显色剂，用于催化H₂O₂生成有色化合物

标准品 1mL×1支 含PLA₂标准液，用于建立标准曲线

ELISA法试剂盒

组分 规格 作用说明

包被板 96孔×1块 预包被抗PLA₂单克隆抗体

酶标抗体 液体6mL×1瓶 含HRP标记抗PLA₂抗体

标准品 液体1mL×6管 含0.1-10U/mL PLA₂标准品

样本稀释液 10mL×1瓶 用于稀释样本和标准品

显色剂A液 6mL×1瓶 含过氧化氢溶液

显色剂B液 6mL×1瓶 含TMB溶液

终止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液

20倍浓缩洗涤液 20mL×1瓶 用于洗涤酶标板

自备仪器与试剂

必备仪器

比色法/酶标法/微量法：紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、恒温水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿/96孔板、研钵、电子天平

ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板、37℃恒温箱、洗板机、可调式移液器、台式离心机

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器、超声破碎仪

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水

样本前处理方法

血清/血浆样本采集：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20°C，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻

组织样本取样：按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20°C，避免反复冻融

细胞/微生物样本收集：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清破碎：按照细菌或细胞数量（10⁴个）:提取液体积(mL)为500~1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

测定操作步骤

比色法/酶标法/微量法操作仪器预热：分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到340nm，蒸馏水调零试剂配制：

底物溶液：将底物用底物缓冲液溶解，配制成5mmol/L的底物溶液

工作液：将试剂一、试剂二和试剂三按1:1:8的比例混合，现配现用样本测定：

试剂名称(μL) 空白管 测定管

蒸馏水/样本 100 100

工作液 700 700

底物溶液 100 100

混匀后37℃水浴10min，记录340nm处的吸光值A空白和A测定标准曲线绘制：将PLA₂标准品稀释成0、5、10、15、20、25U/L系列浓度，同样处理，测定340nm处的吸光值，绘制标准曲线

ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度

结果计算方法

单位定义

U/mL：每毫升样本每分钟生成1μmol游离脂肪酸的酶量

U/mg prot：每毫克组织蛋白每分钟生成1μmol游离脂肪酸的酶量

U/L：每升样本中PLA₂的含量

比色法/酶标法/微量法计算公式

PLA2活性(U/mL)=(A测定−A空白)(A标准−A空白)×标准品浓度×稀释倍数×V总V样×1T×1000PLA2活性(U/mL)=(A标准−A空白)(A测定−A空白)×标准品浓度×稀释倍数×V样V总×T1×1000

A测定：样本管吸光度值

A空白：空白管吸光度值

A标准：标准管吸光度值

标准品浓度：通常为1U/mL

V总：反应体系总体积（mL）

V样：样本体积（mL）

T：反应时间（min）

ELISA法计算公式

PLA2含量(U/L)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数PLA2含量(U/L)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数

性能指标

指标 比色法/酶标法/微量法 ELISA法

线性范围 0~25U/L 0.1-10U/L

最低检测限 ≤0.1U/L ≤0.05U/L

回收率 90%~110% 90%~110%

批内精密度 CV≤2.0% CV≤5.0%

批间精密度 CV≤5.0% CV≤8.0%

稳定性 -20℃保存6-12个月 -20℃保存6-12个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免PLA₂失活；-20℃可保存3个月

组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活

超声波破碎时需控制功率和时间，避免样本降解

试剂使用：

试剂需临用前配制，避免氧化失效

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

标准品需4℃保存，避免反复冻融

测定过程：

反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）

加入样品启动反应后3秒内即刻比色测定

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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