磷脂酶C（PLC）测试盒

磷脂酶C（PLC）测试盒

测定意义与原理

测定意义

磷脂酶C（PLC）是一类催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）水解生成肌醇-1,4,5-三磷酸（IP3）和二酰基甘油（DAG）的酶类，在细胞信号转导中发挥关键作用，其活性检测具有重要意义：临床诊断：诊断和监测肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病等疾病监测：评估细胞信号转导状态、肿瘤进展和治疗效果生物学研究：了解细胞信号转导、细胞增殖、分化和凋亡机制药物研发：筛选PLC抑制剂，用于治疗肿瘤、炎症等疾病

测定原理

酶比色法/分光光度法/微量法：磷脂酶C催化水解NPPC产生对硝基苯酚，在410nm处有特征吸收峰，其颜色深浅在一定范围内与PLC活性成正相关。反应式如下： NPPC→PLC对硝基苯酚+磷脂酸NPPCPLC对硝基苯酚+磷脂酸

ELISA法：采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被磷脂酶C(PLC)抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的磷脂酶C(PLC)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。

试剂盒组成

酶比色法/分光光度法/微量法试剂盒

组分 规格 作用说明

提取液 液体60mL×1瓶 用于提取样本中的PLC

试剂一 液体45mL×1瓶 含反应缓冲液，用于提供适宜的反应pH环境

试剂二 液体10mL×1瓶 含NPPC溶液，反应底物

标准品 1mL×1支 含对硝基苯酚标准液，用于建立标准曲线

ELISA法试剂盒

组分 规格 作用说明

包被板 96孔×1块 预包被抗PLC单克隆抗体

酶标抗体 液体6mL×1瓶 含HRP标记抗PLC抗体

标准品 液体1mL×6管 含0.1-10ng/mL PLC标准品

样本稀释液 10mL×1瓶 用于稀释样本和标准品

显色剂A液 6mL×1瓶 含过氧化氢溶液

显色剂B液 6mL×1瓶 含TMB溶液

终止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液

20倍浓缩洗涤液 20mL×1瓶 用于洗涤酶标板

自备仪器与试剂

必备仪器

酶比色法/分光光度法/微量法：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、恒温水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿/96孔板、研钵、电子天平

ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板、37℃恒温箱、洗板机、可调式移液器、台式离心机

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器、超声破碎仪

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水

样本前处理方法

血清/血浆样本采集：采集血液，静置1-2小时（血清）或使用抗凝剂（血浆）离心：3000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

动植物组织样本取样：按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

细胞/微生物样本收集：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清破碎：按照细菌或细胞数量（10⁴个）:提取液体积(mL)为500~1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

测定操作步骤

酶比色法/分光光度法/微量法操作仪器预热：可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到410nm，蒸馏水调零试剂配制：

试剂二：临用前恢复至室温样本测定：

试剂名称(μL) 空白管 标准管 测定管

蒸馏水 100 -- --

标准品 -- 100 --

样本 -- -- 100

试剂一 700 700 700

试剂二 200 200 200

混匀后37℃水浴10min，记录410nm处的吸光值A空白、A标准和A测定结果计算： PLC活性(U/mL)=A测定−A空白A标准−A空白×标准品浓度×稀释倍数PLC活性(U/mL)=A标准−A空白A测定−A空白×标准品浓度×稀释倍数

ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度

结果计算方法

单位定义

U/mL：每毫升样本每分钟生成1μmol对硝基苯酚的酶量

U/mg prot：每毫克组织蛋白每分钟生成1μmol对硝基苯酚的酶量

ng/mL：每毫升样本中PLC的含量

酶比色法/分光光度法/微量法计算公式

PLC活性(U/mL)=(A测定−A空白)(A标准−A标准空白)×标准品浓度×V总V样×反应时间×稀释倍数PLC活性(U/mL)=(A标准−A标准空白)(A测定−A空白)×标准品浓度×V样V总×反应时间×稀释倍数

A测定：测定管吸光度值

A空白：测定空白管吸光度值

A标准：标准管吸光度值

A标准空白：标准空白管吸光度值

标准品浓度：通常为10mmol/L

V总：反应总体积（mL）

V样：取样量（mL）

反应时间：10min

ELISA法计算公式

PLC含量(ng/mL)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数PLC含量(ng/mL)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数

性能指标

指标 酶比色法/分光光度法/微量法 ELISA法

线性范围 0~100U/L 0.1-10ng/mL

最低检测限 ≤1U/L ≤0.05ng/mL

回收率 90%~110% 90%~110%

批内精密度 CV≤5.0% CV≤3.8%

批间精密度 CV≤8.0% CV≤8.5%

稳定性 2-8℃保存6-12个月 2-8℃保存6-12个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免PLC失活；-20℃可保存3个月

组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活

液体样本需避免溶血和细菌污染

试剂使用：

试剂需临用前配制，避免氧化失效

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

标准品需4℃保存，避免反复冻融

测定过程：

反应温度需严格控制在37℃

加入样品启动反应后3秒内即刻比色测定

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

公司正在出售的产品