乙酰辅酶A羧化酶（ACC）测试盒
测定意义与原理
测定意义
乙酰辅酶A羧化酶（ACC）在生物体内催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A，是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。ACC的活性在一定程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。其活性检测具有重要意义：临床诊断：诊断和监测动脉粥样硬化、冠心病、高脂血症、肝脏疾病等疾病监测：评估脂肪代谢状态、血脂水平和治疗效果生物学研究：了解脂肪代谢、脂蛋白代谢和动脉粥样硬化发病机制药物研发：筛选降脂药物、抗动脉粥样硬化药物等农业应用：研究植物抗逆性机制、果实成熟过程等
测定原理
生化法：在酶作用下分解，被特异性酶氧化产生与显色剂反应的(粉)红色产物，该产物在510nm处有最大吸收峰，通过校正游离的背景值进而得到含量值。
可见分光光度法/钼酸铵定磷法：ACC能够催化乙酰辅酶A、NaHCO₃和ATP生成丙二酰辅酶A、ADP和无机磷，通过钼酸铵定磷法测定无机磷的增加量来测定ACC活性。反应式如下： 乙酰辅酶A+NaHCO3+ATP→ACC丙二酰辅酶A+ADP+无机磷乙酰辅酶A+NaHCO3+ATPACC丙二酰辅酶A+ADP+无机磷
ELISA法：应用双抗体夹心法测定标本中乙酰辅酶A羧化酶(ACC)水平。用纯化的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入乙酰辅酶A羧化酶(ACC)，再与HRP标记的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)呈正相关。
试剂盒组成
生化法试剂盒
组分 规格 作用说明
提取液A1 粉体mg×1支 4℃保存，临用前甩几下使粉剂落入底部，再加3mL的蒸馏水充分溶解备用。
提取液A2 液体μL×1支 临用前甩几下或离心，使粉体落入底部，再加1.1mL蒸馏水溶解备用。
试剂一 液体3mL×1瓶 4℃保存
试剂二 液体8mL×1瓶 4℃保存
试剂三 液体14mL×1瓶 临用前加7mL试剂三混匀备用
标准品 粉剂×1支 临用前加入2mL蒸馏水溶解即5mg/mL的葡萄糖，再稀释10倍成0.5mg/mL备用测定。
可见分光光度法/钼酸铵定磷法试剂盒
组分 规格 作用说明
酸性提取液 25mL×1瓶 4℃保存
碱性提取液 25mL×1瓶 4℃保存
试剂一 液体5mL×1瓶 4℃保存
试剂二 液体1.5mL×1支 4℃保存
试剂三 粉剂×1支 -20℃保存，用时加入1.6mL双蒸水，混匀，4℃保存一周；
试剂四 粉剂×1支 4℃保存，用时加入1.9mL双蒸水，混匀，4℃保存一周；
试剂五 液体0.7mL×1支 4℃保存
试剂六 液体10mL×1瓶 4℃保存
试剂七 自备 19.2mL乙醇和0.8mL蒸馏水充分混合备用。
ELISA法试剂盒
组分 规格 作用说明
包被板 96孔×1块 预包被抗ACC单克隆抗体
酶标抗体 液体6mL×1瓶 含HRP标记抗ACC抗体
标准品 液体1mL×6管 含12.5pg/mL–400pg/mL ACC标准品
样本稀释液 10mL×1瓶 用于稀释样本和标准品
显色剂A液 6mL×1瓶 含过氧化氢溶液
显色剂B液 6mL×1瓶 含TMB溶液
终止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液
30倍浓缩洗涤液 20mL×1瓶 用于洗涤酶标板
自备仪器与试剂
必备仪器
生化法/可见分光光度法/钼酸铵定磷法/微量法：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、恒温水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿/96孔板、研钵、电子天平
ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板、37℃恒温箱、洗板机、可调式移液器、台式离心机
必备耗材
离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器、超声破碎仪
自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水
样本前处理方法
动植物组织样本取样：按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆离心：8000g/12000rpm 4℃/常温离心10min，取上清，置冰上待测
细胞/微生物样本收集：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清破碎：按照细菌或细胞数量（10⁴个）:提取液体积(mL)为500~1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率200W/300W，超声3s，间隔10s/7s，重复30次）离心：8000g/12000rpm 4℃/常温离心10min，取上清，置冰上待测
血清/血浆/脑脊液/尿液样本
血清(浆)样品：直接检测；若为酸性样本则需先用NaOH(2M)调PH值约7.4，然后室温静置30min，取澄清液体直接检测。
土壤样本取样：将样本风干、粉碎、过40目筛，然后称取约0.5g、加入2mL提取液（甲苯）提取：震荡提取20min，12000rpm，4℃，离心20min，取上清待测
测定操作步骤
生化法操作仪器预热：酶标仪预热30min以上，调节波长到510nm，蒸馏水调零试剂配制：
提取液A1：临用前加入3mL蒸馏水充分溶解备用
提取液A2：临用前加入1.1mL蒸馏水充分溶解备用样本测定：
试剂名称(μL) 空白管 测定管
蒸馏水/样本 10 10
工作液 200 200
混匀后37℃水浴10min，记录510nm处的吸光值A空白和A测定标准曲线绘制：将标准品稀释成0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mmol/L系列浓度，同样处理，测定510nm处的吸光值，绘制标准曲线
可见分光光度法/钼酸铵定磷法操作仪器预热：可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到660nm，蒸馏水调零试剂配制：
试剂三：临用前加入1.6mL双蒸水，混匀，4℃保存一周
试剂四：临用前加入1.9mL双蒸水，混匀，4℃保存一周样本测定：
试剂名称(μL) 空白管 测定管
蒸馏水/样本 10 10
试剂一 700 700
试剂二 100 100
试剂三 100 100
混匀后37℃水浴10min，加入试剂四120μL，混匀后于660nm测定吸光度，记为A空白和A测定标准曲线绘制：将标准品稀释成0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mmol/L系列浓度，同样处理，测定660nm处的吸光度，绘制标准曲线
ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将30×洗涤缓冲液用蒸馏水30倍稀释后备用标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释：200U/L、100U/L、50U/L、25U/L、12.5U/L加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。结果计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
结果计算方法
单位定义
U/mg prot：每毫克组织蛋白每分钟生成1nmol无机磷的酶量
U/g 鲜重：每克组织每分钟生成1nmol无机磷的酶量
U/L：每升样本每分钟生成1nmol无机磷的酶量
ng/mL：每毫升样本中ACC的含量
生化法计算公式
ACC活性(U/mg prot)=ΔA×V总ε×d×Cpr×T×V样×109ACC活性(U/mg prot)=ε×d×Cpr×T×V样ΔA×V总×109
ΔA：样本管吸光度变化值
V总：反应体系总体积（L）
ε：NADH摩尔消光系数（6.22×10³ L/mol/cm）
d：比色皿光径（cm）
Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）
T：反应时间（min）
V样：样本体积（L）
可见分光光度法/钼酸铵定磷法计算公式
ACC活性(U/mg prot)=(A测定−A空白)(A标准−A空白)×标准品浓度×V总V样×稀释倍数ACC活性(U/mg prot)=(A标准−A空白)(A测定−A空白)×标准品浓度×V样V总×稀释倍数
A测定：样本管吸光度值
A空白：空白管吸光度值
A标准：标准管吸光度值
V总：反应体系总体积（mL）
V样：样本体积（mL）
ELISA法计算公式
ACC含量(ng/mL)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数ACC含量(ng/mL)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数
性能指标
指标 生化法/可见分光光度法/钼酸铵定磷法/微量法 ELISA法
线性范围 0~50U/L 12.5pg/mL–400pg/mL
最低检测限 ≤0.1U/L ≤1.0μg/mL
回收率 90%~110% 90%~110%
批内精密度 CV≤1.7% CV≤5.0%
批间精密度 CV≤5.0% CV≤8.0%
稳定性 2-8℃保存6-12个月 2-8℃保存6-12个月
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免ACC失活；-20℃可保存3个月
组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活
超声波破碎时需控制功率和时间，避免样本降解
试剂使用：
试剂需临用前配制，避免氧化失效
不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线
标准品需4℃保存，避免反复冻融
测定过程：
反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）
加入样品启动反应后3秒内即刻比色测定
若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定
质量控制：
每次实验需设置空白对照和质控样本
定期校准仪器，确保检测结果准确性
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确
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