脂氧合酶 （LOX)测试盒
测定意义与原理
测定意义
脂氧合酶（LOX）是一种含铁的氧化还原酶，存在于动、植物体内，催化不饱和脂肪酸氧化反应，导致膜脂过氧化，在植物的生长发育、成熟衰老及逆境胁迫过程中具有重要作用，其活性检测具有重要意义：临床诊断：诊断和监测炎症性疾病、心血管疾病、神经系统疾病等疾病监测：评估氧化应激状态、组织损伤程度和治疗效果生物学研究：了解花生四烯酸代谢途径、细胞凋亡和细胞增殖机制药物研发：筛选LOX抑制剂，用于治疗炎症、癌症和心血管疾病植物学研究：研究植物抗逆性机制、果实成熟衰老和信号转导途径
测定原理
荧光法：LOX催化花生四烯酸氧化生成荧光产物，根据单位时间内荧光产物在激发波长507nm，发射波长547nm处的荧光值变化，计算LOX的酶活。
ELISA法：采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)，用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的抗原呈正相关，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。
紫外分光光度法/微量法：LOX催化亚油酸氧化，氧化产物在234nm/280nm处有特征吸收峰；测定234nm/280nm吸光度增加速率，来计算LOX活性。反应式如下： 亚油酸→LOX氧化产物亚油酸LOX氧化产物
试剂盒组成
荧光法试剂盒
组分 规格 作用说明
提取液 液体60mL×1瓶 用于提取样本中的LOX
试剂一 液体45mL×1瓶 含反应缓冲液，用于提供适宜的反应pH环境
试剂二 液体10mL×1瓶 含花生四烯酸溶液，反应底物
标准品 1mL×1支 含LOX标准液，用于建立标准曲线
ELISA法试剂盒
组分 规格 作用说明
包被板 96孔×1块 预包被抗LOX单克隆抗体
酶标抗体 液体6mL×1瓶 含HRP标记抗LOX抗体
标准品 液体1mL×6管 含0.1-10ng/mL LOX标准品
样本稀释液 10mL×1瓶 用于稀释样本和标准品
显色剂A液 6mL×1瓶 含过氧化氢溶液
显色剂B液 6mL×1瓶 含TMB溶液
终止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液
20倍浓缩洗涤液 20mL×1瓶 用于洗涤酶标板
紫外分光光度法/微量法试剂盒
组分 规格 作用说明
提取液 液体60mL×1瓶 用于提取样本中的LOX
试剂一 液体45mL×1瓶 含反应缓冲液，用于提供适宜的反应pH环境
试剂二 液体10mL×1瓶 含亚油酸溶液，反应底物
自备仪器与试剂
必备仪器
荧光法：荧光酶标仪、台式离心机、恒温水浴锅、可调式移液器、96孔板、研钵、电子天平
ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板、37℃恒温箱、洗板机、可调式移液器、台式离心机
紫外分光光度法/微量法：紫外分光光度计、1mL石英比色皿、台式离心机、恒温水浴锅、可调式移液器、研钵、电子天平
必备耗材
离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器、超声破碎仪
自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水
样本前处理方法
动植物组织样本取样：按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆离心：8000g/16000g 4℃离心10min/20min，取上清，置冰上待测
细胞/微生物样本收集：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清破碎：按照细菌或细胞数量（10⁴个）:提取液体积(mL)为500~1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测
血清/血浆样本
血清(浆)样品：直接检测
发酵液/食品/饲料/土壤样本提取：称取适量样本，加入提取液，振荡提取30min离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测
测定操作步骤
荧光法操作仪器预热：荧光酶标仪预热30min以上，调节激发波长到507nm，发射波长到547nm，蒸馏水调零试剂配制：
试剂二：临用前加入10mL蒸馏水充分溶解备用样本测定：
试剂名称(μL) 空白管 测定管
蒸馏水/样本 100 100
试剂一 700 700
试剂二 200 200
混匀后37℃水浴10min，记录507nm激发波长、547nm发射波长处的荧光值F空白和F测定标准曲线绘制：将LOX标准品稀释成0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0U/mL系列浓度，同样处理，测定荧光值，绘制标准曲线
ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：
从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃
设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度
紫外分光光度法/微量法操作分光光度计预热30min以上，调节波长到234nm/280nm，蒸馏水调零试剂在25℃水浴中预热30min以上空白管：依次在1mL石英比色皿中加入100μL蒸馏水、800μL试剂和100μL试剂二，迅速混匀后于234nm/280nm比色，记录15s和75s的吸光值，分别记为A1和A2测定管：依次在1mL石英比色皿中加入100μL上清液、800μL试剂和100μL试剂二，迅速混匀后于234nm/280nm比色，记录15s和75s的吸光值，分别记为A3和A4计算ΔA空白=A2-A1，ΔA测定=A4-A3
结果计算方法
单位定义
U/mg prot：每毫克组织蛋白每分钟生成1nmol氧化产物的酶量
U/g 鲜重：每克组织每分钟生成1nmol氧化产物的酶量
U/L：每升样本每分钟生成1nmol氧化产物的酶量
U/g 干重：每克干物质每分钟生成1nmol氧化产物的酶量
荧光法计算公式
LOX活性(U/mg prot)=(F测定−F空白)×V总C标准品×Cpr×T×V样×109LOX活性(U/mg prot)=C标准品×Cpr×T×V样(F测定−F空白)×V总×109
F测定：样本管荧光值
F空白：空白管荧光值
V总：反应体系总体积（L）
C标准品：标准品浓度（U/mL）
Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）
T：反应时间（min）
V样：样本体积（L）
ELISA法计算公式
LOX含量(ng/mL)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数LOX含量(ng/mL)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数
紫外分光光度法/微量法计算公式
LOX活性(U/mg prot)=ΔA测定−ΔA空白ε×d×Cpr×T×V样×109LOX活性(U/mg prot)=ε×d×Cpr×T×V样ΔA测定−ΔA空白×109
ΔA测定：测定管吸光度变化值
ΔA空白：空白管吸光度变化值
ε：氧化产物摩尔消光系数（2.5×10⁴ L/mol/cm）
d：比色皿光径（cm）
Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）
T：反应时间（min）
V样：样本体积（L）
性能指标
指标 荧光法/紫外分光光度法/微量法 ELISA法
线性范围 0~0.50U/L 0.1-10ng/mL
最低检测限 ≤0.05U/L ≤0.05ng/mL
回收率 90%~110% 90%~110%
批内精密度 CV≤1.7% CV≤5.0%
批间精密度 CV≤5.0% CV≤8.0%
稳定性 2-8℃保存6-12个月 2-8℃保存6-12个月
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免LOX失活；-20℃可保存3个月
组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活
液体样本需避免溶血和细菌污染
发酵液/食品/饲料/土壤样本需按比例提取，避免杂质干扰
试剂使用：
试剂需临用前配制，避免氧化失效
不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线
标准品需4℃保存，避免反复冻融
测定过程：
反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）
加入样品启动反应后3秒内即刻比色测定
若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定
质量控制：
每次实验需设置空白对照和质控样本
定期校准仪器，确保检测结果准确性
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确
ELISA法特别注意事项：
严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂
洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉
消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值
底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用
避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果
在储存和温育时避免强光直接照射
平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上
任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性
不能使用过期产品
如果可能传播，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置
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