超氧阴离子测试盒 新品

商品属性

测定意义与原理

测定意义

超氧阴离子（O₂⁻·）是一种活性氧自由基，是有氧代谢的副产物，其生理和病理意义包括：氧化应激标记：直接反映细胞内氧化还原状态，是氧化损伤的重要指标植物抗逆性：参与植物对干旱、盐渍、重金属、高温等逆境胁迫的响应疾病关联：与动脉粥样硬化、心脑血管疾病、癌症、神经退行性疾病等密切相关免疫防御：在免疫细胞中作为杀伤病原体的重要武器信号传导：参与细胞增殖、分化、凋亡等生理过程的信号调控

测定原理

采用羟胺氧化法，超氧阴离子（O₂⁻·）与羟胺反应生成亚硝酸盐，亚硝酸盐在酸性条件下与对氨基苯磺酸和α-萘胺反应生成红色偶氮化合物，在530nm处有最大吸收峰，吸光度与O₂⁻·含量成正比。反应式如下： 2O2−+NH2OH→NO2−+O2+H2O2O2−+NH2OH→NO2−+O2+H2O NO2−+对氨基苯磺酸+α-萘胺→酸性条件红色偶氮化合物NO2−+对氨基苯磺酸+α-萘胺酸性条件红色偶氮化合物

试剂盒组成

组分 规格 作用说明

试剂A 液体25mL×1瓶 含0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.2，用于反应体系构建

试剂B 液体10mL×1瓶 含10mmol/L盐酸羟胺溶液，反应底物

试剂C 液体10mL×1瓶 含对氨基苯磺酸-α-萘胺混合液，显色剂

试剂D 液体10mL×1瓶 含3mol/L乙酸溶液，提供酸性反应环境

标准品 液体1mL×1支 含100μmol/L NaNO₂标准品，用于建立标准曲线

提取液 液体100mL×1瓶 含0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.2，用于样本提取

自备仪器与试剂

必备仪器

分光光度计/酶标仪（530nm检测通道）

低温离心机（≥8000g）

恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）

可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）

研钵/组织匀浆器（冰浴专用）

必备耗材

1mL玻璃比色皿/96孔板

离心管（1.5mL、10mL）

一次性无菌吸头

手术剪/镊子（用于组织样本处理）

自备试剂

蒸馏水/去离子水

生理盐水（0.85% NaCl）

液氮（可选，用于植物样本速冻）

样本前处理方法

动植物组织样本取新鲜组织，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分称取约0.1g组织，加入1mL预冷提取液，冰浴匀浆8000g 4℃离心15min，取上清液置冰上待测若O₂⁻·含量过高，可用提取液稀释1-10倍后测定

细胞/细菌样本收集对数生长期细胞/细菌，8000g 4℃离心5min弃上清按照细胞/细菌数量(10⁴个):提取液体积(mL)=500~1000:1的比例（建议500万细胞/细菌加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）8000g 4℃离心15min，取上清液置冰上待测

植物叶片样本取新鲜叶片，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分称取约0.1g叶片，加入1mL预冷提取液，冰浴匀浆8000g 4℃离心15min，取上清液置冰上待测若O₂⁻·含量过高，可用提取液稀释1-10倍后测定

测定操作步骤

羟胺氧化法操作

试剂准备：

试剂A：液体25mL×1瓶，4℃保存

试剂B：液体10mL×1瓶，-20℃保存，用时加10mL蒸馏水溶解

试剂C：液体10mL×1瓶，4℃保存

试剂D：液体10mL×1瓶，4℃保存

显色工作液：试剂C + 试剂D，按体积比1:1混合，现配现用

标准曲线建立：

配制NaNO₂标准系列：0、5、10、20、40、80μmol/L

取比色管，加入标准品溶液0.5mL + 显色工作液0.5mL，混匀

25℃室温反应20min，530nm波长下测定吸光度

以NaNO₂浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线

样本测定：

分光光度计预热30min，调节波长到530nm，蒸馏水调零

反应管：取比色管，加入样本0.5mL + 试剂B 0.5mL，混匀，25℃反应20min

空白管：取比色管，加入提取液0.5mL + 试剂B 0.5mL，混匀，25℃反应20min

向反应管和空白管各加入显色工作液0.5mL，混匀，25℃反应20min

530nm波长下测定吸光度（A样、A空）

荧光法操作（可选）

试剂准备：

荧光探针：DHE（二氢乙啶），浓度10μmol/L

缓冲液：0.1mol/L PBS，pH7.4

染色：

取样本100μL，加入DHE探针1μL，37℃孵育30min

用PBS洗涤2次，离心弃上清

加入PBS重悬，上流式细胞仪或荧光显微镜检测

检测参数：激发波长488nm，发射波长610nm

结果计算方法

单位定义

nmol/g鲜重：每克组织鲜重中O₂⁻·含量

nmol/mL：每毫升样本中O₂⁻·含量

nmol/mgprot：每毫克蛋白中O₂⁻·含量

计算公式

O2−含量(nmol/g鲜重)=(A样−A空)×V总×D(A标−A空标)×C标×WO2−含量(nmol/g鲜重)=(A标−A空标)×C标×W(A样−A空)×V总×D

A样-A空：样本扣除空白后的吸光度值

V总：样本提取液总体积（mL）

D：样本稀释倍数（未稀释则为1）

A标-A空标：标准品扣除空白后的吸光度值

C标：标准品浓度（nmol/mL）

W：组织鲜重（g）

简化公式

按鲜重计算：O₂⁻·（nmol/g鲜重）= 200×(A样-A空)÷W

按液体体积计算：O₂⁻·（nmol/mL）= 200×(A样-A空)

按蛋白含量计算：O₂⁻·（nmol/mgprot）= 200×(A样-A空)÷Cpr

性能指标

指标 要求

线性范围 0~100nmol/mL，线性相关系数r≥0.995

最低检测限 ≤0.5nmol/L

回收率 90%~110%

批内精密度 CV≤5.0%

批间精密度 CV≤8.0%

稳定性 4℃保存12个月，活性保留≥90%

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，超氧阴离子半衰期短，易分解；-80℃可保存1周

匀浆与超声破碎需在冰浴中进行，控制温度在0-4℃

样本处理过程中需避免氧气暴露，尽量减少与空气接触

试剂使用：

盐酸羟胺溶液需现配现用，避免氧化

显色剂对光敏感，配制后需避光保存，24小时内用完

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

反应温度和时间需严格控制在25℃、20min

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

每个样本需设置至少3个平行实验，结果取平均值

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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